鄰苯二甲醛對還原型谷胱甘肽的光譜分析
——推薦一個儀器分析實驗

張鵬，張倩，鐘華，丁彩鳳

青島科技大學化學與分子工程學院，光電傳感與生命分析教育部重點實驗室，山東省生化分析重點實驗室，山東省生命分析高校重點實驗室，山東 青島 266042

儀器分析是化學學科的重要分支，主要是借助特殊儀器，以物質的理化性質為基礎建立起來的分析方法。它具有分析能力強、分析速度快、檢測靈敏度高等優(yōu)點[1,2]。作為高等院校化學及相關專業(yè)學生的必修課程，儀器分析實驗通常包含了光譜分析、電化學分析和色譜分析等幾個領域。其中光譜分析是常用的快速、靈敏、準確的現(xiàn)代儀器分析方法之一，它主要是利用物質的特征光譜研究其結構或測定其成分的方法。光譜分析法主要有紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜、紅外光譜等[3,4]。

還原型谷胱甘肽(GSH)是一種含巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，在體內(nèi)協(xié)助維持機體的免疫系統(tǒng)，并具有抗氧化性和解毒功能。因此，對GSH含量的檢測可為疾病的診斷和健康評估提供有效的數(shù)據(jù)。目前GSH的檢測方法主要有還原酶法、量熱法、分光光度法、色譜法、毛細管電泳法等。與之相比，光譜分析法，尤其是熒光分析法，可在生物體中實現(xiàn)無創(chuàng)原位成像分析，具有良好的生物應用前景。因此，開發(fā)可用于GSH檢測的光譜分析方法引起了廣泛的關注[5]。

近幾十年來，有機分子探針的設計與檢測性能研究獲得了長足的發(fā)展，尤其是紫外-可見吸收光譜法(比色法)和熒光光譜法[6]，研究者們對其產(chǎn)生了極大的興趣，遺憾的是在校本科生對該領域的接觸機會不多。有機分子探針的研究涉及有機化學、分析化學、無機配位化學以及物理化學等方面的專業(yè)基礎知識，并且通過多種儀器研究探針分子的檢測性能，探索檢測機理。因此，如果可以將分子探針的設計和應用研究納入本科生的教學中，不僅可以使學生掌握分析檢測新方法，了解分析儀器的工作原理和使用方法，而且可以促進學生對所學多學科知識的融會貫通，激發(fā)學生對前沿科學研究的熱情和興趣。

本實驗采用商品化的試劑鄰苯二甲醛(OPA)作為探針分子，避免了探針分子的合成與分離，保障了實驗教學在有限課時內(nèi)順利實施。實驗內(nèi)容包含標準溶液的配制、紫外-可見吸收/熒光光譜測試、檢測限的計算、結合比的確定及分析機理的驗證(包括核磁共振氫譜和高分辨質譜)等幾部分。本實驗適用于化學及相關專業(yè)高年級本科生的教學，使學生體驗科學研究的趣味性與嚴謹性，培養(yǎng)正確的科學態(tài)度，為后續(xù)的繼續(xù)深造和就業(yè)打下基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗目的

(1) 掌握紫外-可見分光光度計和熒光分光光度計的基本操作。

(2) 掌握分子探針法對分析物的測定方法。

(3) 學習動態(tài)弱相互作用的光譜分析方法。

(4) 學習核磁共振波譜儀和質譜儀的使用。

(5) 掌握實驗數(shù)據(jù)處理和實驗結果分析能力，培養(yǎng)學生的創(chuàng)新意識。

1.2 實驗原理

含巰基的物質和醛類可以發(fā)生親核加成反應形成半縮硫醛，如圖1a所示。伯胺類化合物可以和醛脫水反應形成亞胺(圖1b)。將此二者有機結合起來，即含有兩個醛基的鄰苯二甲醛可以和既含有巰基又含有氨基的物質發(fā)生反應形成巰基取代的噻唑類化合物(圖1c)[7,8]，該結構在350 nm紫外光照射下有藍色熒光。因此，OPA可以和既含有巰基又含有氨基的還原型谷胱甘肽反應生成苯并噻唑類物質(圖2)，如果將OPA與GSH的溶液混合，二者反應會出現(xiàn)苯并噻唑特有的光譜，在340 nm附近出現(xiàn)明顯的紫外吸收峰，420 nm處有亮藍色熒光出現(xiàn)，說明OPA可以用于GSH的光譜檢測。

圖1 巰基(a)或氨基(b)類化合物與醛類物質的反應和OPA與巰基和氨基類化合物的反應(c)

圖2 探針OPA與GSH的反應方程式

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器

EL104電子分析天平(瑞徽電子，中國)，F(xiàn)E20實驗室用pH計(米科，中國)，UH5300紫外-可見分光光度計(Hitachi，日本)，F(xiàn)-4600熒光分光光度計(Hitachi，日本)，365 nm紫光燈，ICP-MS電耦合等離子體質譜儀(PerkinElmer，美國)，500 MHz核磁共振波譜儀(Bruker，瑞士)。

1.3.2 試劑

分析純鄰苯二甲醛(> 99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，還原型谷胱甘肽(≥ 98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，二水合磷酸二氫鈉(≥ 99.0%，國藥集團化學試劑有限公司)，十二水合磷酸氫二鈉(≥ 99.0%，國藥集團化學試劑有限公司)，光譜純二甲基亞砜(≥ 99.0%，生工生物工程股份有限公司)，去離子水(實驗室自制)。

1.4 實驗內(nèi)容

1.4.1 溶液配制

準確稱量0.0134 g鄰苯二甲醛，加入10 mL DMSO溶解，配制成濃度為1 × 10?2mol?L?1的溶液。準確稱取0.0307 g還原型谷胱甘肽，用10 mL去離子水溶解，配制成濃度為1 × 10?2mol?L?1的溶液。用二水合磷酸二氫鈉和十二水合磷酸氫二鈉配制濃度1 × 10?2mol?L?1，pH為7.2的緩沖液。

1.4.2 光譜測試

準確移取25 μL上述鄰苯二甲醛溶液，向其中加入2.0 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，再加入一定體積的谷胱甘肽溶液，用PBS緩沖液稀釋至5.0 mL。此時溶液中鄰苯二甲醛的濃度為5 × 10?4mol?L?1。將此溶液在25 °C下靜置20 min后用1 cm石英池測其紫外-可見吸收光譜和熒光光譜。熒光光譜測試時，設置儀器激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長為350 nm。

1.4.3 GSH檢測限的測定

向含有5 × 10?4mol?L?1OPA的PBS緩沖溶液中加入不同濃度的GSH，使得最終溶液中GSH與OPA的比例為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0。溶液靜置20 min后測試紫外-可見吸收光譜和熒光光譜，分別以340 nm處吸光度和420 nm處熒光強度對GSH濃度做校準曲線，計算其斜率k。根據(jù)LOD = 3.3s/k計算OPA對GSH的檢測限[9,10]，式中，LOD表示檢測限，k為校準曲線的斜率，s為OPA空白樣品的標準偏差(測試11次)。

1.4.4 OPA與GSH結合比的測定

OPA與GSH之間以兩重動態(tài)可逆共價鍵結合，因此，可采用等摩爾連續(xù)變化(Job’s plot)法測定二者結合比[11]。具體實驗方法是保持溶液中OPA與GSH的濃度之和為1 × 10?3mol?L?1，逐漸改變二者比例，配制如表1所示的11組溶液，分別測試其紫外-可見吸收光譜，用420 nm吸光度對X(X=[GSH]/([OPA] + [GSH]))值作圖，得到Job’s plot曲線，擬合曲線獲得拐點可知二者的結合比。

表1 Job’s Plot (OPA與GSH)濃度配量表

1.4.5 GSH檢測機理的驗證

(1) 核磁共振氫譜(1H NMR)。分別測試OPA以及OPA與GSH反應生成物的核磁共振氫譜，通過對比分析證實二者的反應機理。

(2) 高分辨質譜(HR-MS)。測試OPA與GSH反應液的高分辨質譜，分析質譜數(shù)據(jù)，驗證反應機理。核磁共振氫譜和高分辨質譜測試樣品由學生準備，相關教師負責測試。

2 結果與討論

2.1 紫外-可見吸收光譜和熒光光譜測試

如圖3a所示，OPA在PBS緩沖液中的最大吸收峰在260 nm附近，300 nm處的吸收峰為n–π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶，溶液呈無色，GSH在所測試范圍內(nèi)沒有吸收峰，將二者混合后于340 nm處出現(xiàn)很強的吸收峰，溶液顏色隨之變?yōu)榈S色。對應的熒光光譜顯示(圖3b)，OPA與GSH完全沒有熒光發(fā)射，而二者混合液在420 nm處出現(xiàn)明顯的熒光信號，在365 nm紫光燈下顯示亮藍色熒光。這些光譜數(shù)據(jù)表明OPA可以用于GSH的紫外/熒光雙通道檢測。

圖3 在PBS緩沖溶液中OPA、GSH以及OPA + GSH的紫外-可見吸收光譜(a)和熒光光譜(b)

2.2 檢測限測定結果

如圖4(a)所示，向含有5 × 10?4mol?L?1OPA的PBS緩沖溶液中加入不同濃度的GSH，隨著GSH濃度的增大，溶液在340 nm處的吸光度不斷增加，吸光度與GSH和OPA濃度比呈線性(y= 2.56x? 0.0077，線性相關系數(shù)為0.9938)，擬合結果如圖4(b)所示，依此計算OPA對GSH的檢測限是1.6 × 10?7mol?L?1。

圖4 (a) OPA與不同濃度的GSH作用后的紫外-可見吸收光譜；(b) 340 nm吸光度的線性擬合

對應的熒光光譜如圖5所示，隨著GSH濃度的增大溶液在420 nm處的熒光發(fā)射峰不斷增強，420 nm熒光強度與GSH和OPA濃度比也呈良好的線性(y= 5706.42x? 100.62，線性相關系數(shù)為0.9914)，由熒光強度計算OPA對GSH的檢測限是8.4 × 10?8mol?L?1。

圖5 (a) OPA與不同濃度的GSH作用后的熒光光譜；(b) 420 nm熒光強度的線性擬合

2.3 OPA與GSH結合比

采用等摩爾連續(xù)變化(Job’s Plot)法探討OPA與GSH結合比，通過測試配制的11組溶液紫外-可見吸收光譜，以340 nm吸光度對X值作圖，得到Job’s plot曲線如圖6所示，可見X值為0.5處是兩側曲線擬合線的交點，說明OPA與GSH之間的結合比為1 : 1。

圖6 OPA與GSH反應的Job’s plot曲線

2.4 GSH檢測機理的驗證

2.4.1 核磁共振氫譜

分別測試OPA以及OPA與GSH反應生成物的核磁共振氫譜，通過對比證實二者的反應機理。鄰苯二甲醛在水溶液中存在時會有單水合物和二水合物(C6H4(CHO)(CH(OH)2)和C6H4(CH(OH))2O)存在(圖7)[12]，因此其核磁共振氫譜出現(xiàn)兩套峰(圖8)，10.3處是醛基氫的信號，7.82和7.92處的兩組峰為OPA苯環(huán)質子信號，6.15、6.36和7.30是OPA二水合物的信號峰；GSH在低場沒有信號。將而這混合后可發(fā)現(xiàn)10.3、7.82和7.92的信號明顯降低，7.3–7.4間的信號增強，說明OPA與GSH作用形成苯并噻唑環(huán)。

圖7 鄰苯二甲醛與其單水合物、二水合物的結構式

圖8 OPA與GSH反應前后的核磁共振氫譜

2.4.2 高分辨質譜

向含有5 × 10?4mol?L?1OPA的PBS緩沖液中加入等物質的量的GSH，反應完成后的溶液測試高分辨質譜，采用ESI離子源，負離子模式。由圖9可以看出，ESI-MS數(shù)據(jù)顯示OPA與GSH作用后出現(xiàn)404.0923 (m/z)的負離子信號峰，測試結果與預期產(chǎn)物的理論計算值一致(C18H18N3O6S?的理論計算值：404.0922)，進一步證實了OPA與GSH的反應機理。

圖9 OPA與GSH反應后的高分辨質譜

3 實驗的實施與反饋

我們在本學院化學專業(yè)本科三年級的學生中已經(jīng)開展了三輪本實驗的教學，教學效果良好，學生反饋積極。具體的實驗教學以小組為單位施行，2–3人一組，實驗設定4個學時。3次實驗教學均順利完成，學生基本能夠在規(guī)定時間內(nèi)完成實驗，并能夠準確分析實驗數(shù)據(jù)、撰寫實驗報告。學生普遍反映該實驗不僅學習了多種分析儀器的使用以及數(shù)據(jù)分析方法，并且整個實驗過程充滿了趣味性，讓他們充分體驗到了探索性研究的樂趣。

4 拓展思考

(1) OPA的水合作用對GSH的檢測有什么影響？

(2) 哪些因素會影響OPA對GSH檢測的準確性？

(3) 如果溶液中含有半胱氨酸時會對GSH的檢測造成什么樣的影響？

5 結語

介紹了一個適合化學及相關專業(yè)本科生教學的儀器分析創(chuàng)新實驗。本實驗用市售試劑OPA作為底物，通過光譜分析法檢測GSH，綜合了分析化學、有機化學、物理化學等學科的基礎知識和實驗操作技能，促進學生對不同學科知識的融會貫通，提升了學生的實驗操作技能及數(shù)據(jù)分析處理能力，調動了學生的科研興趣。本實驗與前沿科學研究密切接軌，以實驗課堂教學的方式向本科生介紹前沿科研，加速學生對科研的融入，充分激發(fā)其科研熱情，為學生畢業(yè)后的繼續(xù)深造和就業(yè)奠定基礎。