超高效合相色譜法測定咖啡因含量實驗設計

謝一凡，姚莉韻,,＊，嚴忠紅，蔡玉興，金玉杰，李寧

1上海交通大學醫學院，基礎醫學實驗教學中心，上海 200025

2上海交通大學醫學院，藥物化學與生物信息學中心，上海 200025

咖啡因(caffeine)是從茶葉、咖啡果中提取出來的一種黃嘌呤生物堿[1]，化學名為1,3,7-三甲基黃嘌呤，屬于一類中樞神經興奮劑，適量食用有助于提神、去疲勞，因此含有咖啡因成分的能量飲料十分暢銷。但由于咖啡因具有刺激中樞神經的功能，長期或過量食用對人體有害且易成癮。因此對飲料中咖啡因含量快速、準確的測定，有助于人們科學合理地攝入相關產品。

用于檢測咖啡因的分析儀器有多種，目前報道的主要有紫外光譜法、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)及液相色譜串聯質譜法(LC-MS)[2–4]等，這些方法檢測時間均較長，而且在樣品前處理中，都需要使用較多有機溶劑，對環境和和操作人員健康不利。

超高效合相色譜法(Ultra Performance Convergence Chromatography，UPCC或UPC2)利用超臨界二氧化碳(CO2)與少量有機溶劑(甲醇、乙醇等)為流動相，通過調節有機溶劑的比例及系統反壓，使流動相的極性和密度發生變化，從而控制樣品的分離效果。其優點是用無毒的CO2代替了有毒的揮發性有機溶劑，不僅減少廢液處理環節、節省成本，而且可降低對環境和實驗人員健康的危害[5,6]。目前，許多色譜技術(如GC、HPLC、LC-MS等)已被廣泛應用于生命科學研究及臨床醫學測試中，而UPC2作為一種新型色譜分離技術，不僅拓展了氣相色譜、反相高效色譜技術的局限性，能完全代替正相色譜技術，而且具有快速、高效、綠色環保及分離能力強的優點[7]。將UPC2應用于儀器分析實驗教學，符合培養高素質、綜合能力強的醫學人才的需求。

本實驗選用生活中廉價易得的三種飲料，采用UPC2測定其中咖啡因的含量，同時涉及稱量、溶解、定容等多項分析化學的基本實驗操作，內容貼近生活，能激發學生的實驗興趣，適合一年級醫學生儀器分析實驗要求。本實驗將化學分析與儀器分析的內容有機結合，使學生在掌握UPC2原理和操作技能的同時，能對所學知識進行梳理和總結，利于培養學生的實踐能力和創新思維[8]。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

儀器：超高效合相色譜儀(ACQUITY UPC2，美國Waters公司)，XS105電子分析天平(Mettler Toledo，瑞士)，USC-302超聲波清洗儀(上海波龍電子設備有限公司)，色譜柱(ACQUITY UPC2?BEH柱3.0 × 100 mm，1.7 μm)。

試劑：咖啡因標準品(上海試劑二廠，純度≥98%)，可口可樂(500 mL)，統一綠茶(茉莉味，低糖，500 mL)，三得利烏龍茶(無糖，500 mL)，甲醇(TEDIA，HPLC級，美國)，二氧化碳(食品級CO2，上海成功氣體工業有限公司)。

1.2 咖啡因儲備液和樣品溶液的配制

(1) 準確稱取咖啡因對照品約10.00 mg于100 mL的容量瓶中，加70 mL甲醇，超聲溶解后，再用甲醇定容、搖勻，得濃度為0.1 mg·mL?1的溶液。移取此溶液5 mL于50 mL的容量瓶中，甲醇稀釋定容、搖勻，得濃度為10 μg·mL?1的儲備液。

(2) 使用移液槍分別移取可樂、綠茶、烏龍茶各0.5 mL，分別置于3個10 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋定容、搖勻，即得樣品溶液供測試用。

1.3 實驗設計

本實驗分組進行，每個大組6人共同完成色譜條件優化、系統適應性考查及精密度實驗。每個大組再分為2小組，每組3人合做一條標準曲線，并測定三個飲料樣品。本實驗為3學時。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的確定

考慮到柱溫、流速、系統背壓等條件的變化對樣品的分離影響不大，因此本實驗只考查流動相組成配比對分離的影響。色譜柱：ACQUITY UPC2?BEH柱(3.0 × 100 mm,1.7 μm)；流速：1.5 mL·min?1；檢測波長：272 nm；柱溫：25 °C；系統背壓2000 Psi；進樣量：1 μL；采集時間2 min。選用CO2-甲醇的流動相配比分別為85 : 15、90 : 10、95 : 5，用烏龍茶作為樣品進行測試，通過對咖啡因色譜峰的保留時間、峰高、對稱性、與雜質峰溶劑峰的分離度等考查，確定最佳流動相的配比。

從UPC2色譜圖上可知(圖1)，CO2-甲醇的配比為90 : 10時，咖啡因色譜峰保留時間約為0.82 min(其中0.39 min為溶劑峰)，保留時間合適、峰型對稱，理論塔板數高，溶劑甲醇對樣品測定無干擾，因此，90 : 10為最佳流動相配比。

圖1 流動相配比對咖啡因分離效果的影響

在此優化的流動相配比下(90 : 10)，分別注入純甲醇、咖啡因標準品溶液及樣品溶液，根據所得色譜圖，可以發現三種飲料的溶劑峰、雜質峰和咖啡因主峰完全分開，不干擾測試，符合定量分析的要求(圖2)。

圖2 溶劑、咖啡因標準品及飲料色譜圖

2.2 精密度和檢測波長

在優化色譜條件下，取濃度為10 μg·mL?1的咖啡因溶液連續進樣5次，計算5次的色譜峰保留時間和峰面積的相對平均偏差值(RSD)，用于考查儀器的精密度。結果顯示，保留時間的RSD為0.086%，峰面積的RSD為0.75%，表明儀器精密度達到測試要求(圖3)。

圖3 重復進樣5次的咖啡因色譜疊加圖

通過PDA檢測器掃描后，從色譜圖上提取咖啡因的紫外光譜圖，得最大吸收波長為272 nm (圖4)。

圖4 咖啡因的紫外光譜圖

2.3 標準曲線和樣品的測定

將咖啡因儲備液稀釋為近似濃度0.5、1、5、8、10 μg·mL?1的系列標準溶液(標準液實際濃度見表1)。在優化色譜條件下分別進行測定，以濃度X與對應的色譜峰峰面積Y進行線性擬合得回歸方程。結果顯示，在0.5–10 μg·mL?1濃度范圍內，咖啡因濃度與對應的峰面積值之間的線性關系良好(圖5)。應用Excel軟件獲得回歸方程：Y= 1627.1X+ 189.47，R2= 1。

圖5 咖啡因的標準曲線

表1 三種飲料中咖啡因濃度測定的結果*

根據三種樣品溶液分別進樣后獲得的色譜圖，將色譜峰峰面積代入回歸方程，即可計算溶液中的咖啡因含量，再通過換算即可得出飲料中咖啡因的含量。

3 實驗設計及教學效果

3.1 實驗設計理念

由于UPC2作為大型精密分析儀器，價格較昂貴，實驗室只有1臺。為使所有學生能充分了解和掌握儀器工作原理和操作方法，本實驗采用了線上線下混合式的教學模式。在實驗開始前2周，要求學生登錄化學實驗課程網站，觀看UPC2的虛擬仿真實驗視頻，借助虛擬技術讓學生模擬儀器操作，增加對實驗儀器的感性認識。教師同時在線發布預習思考題：(1) UPC2的原理及特點；(2) 從儀器部件、被分析樣品類型、流動相特點、色譜柱差異等方面比較UPC2與LC、GC的異同點；(3) 何謂超臨界CO2，超臨界CO2如何形成及其理化性質；(4) 與反相高效液相色譜相比，UPC2流動相的組成如何影響樣品分離度、峰高及保留時間。引導學生充分利用網絡資源，查閱文獻完成相關知識點的學習，既培養了學生自學能力，又提高了學習積極性。

3.2 教學效果評價

教學結果表明，本實驗樣品處理簡單、快速，實驗操作安全、環保，數據結果準確、可靠，儀器可操作性強，并能與儀器分析理論知識緊密結合。同時通過線上線下混合式教學模式，學生事先對儀器結構及操作方法了解充分，使其能在規定的實驗課時內，順利完成所有測試工作，并獲得實驗數據。

本實驗要求每個學生單獨完成一份實驗報告，報告中除了基本實驗內容外，還有預習思考題的回答、實驗過程的討論等，可以提高學生分析、歸納、解決問題的能力。我們針對參與實驗的三屆學生(預防專業)共90人發放問卷調查，結果顯示，對實驗效果的總體滿意率達92% (圖6)。

圖6 問卷調查結果

4 結語

以往HPLC、GC等分析化學實驗，由于這些大型精密分析儀器價格昂貴而數量少，受實驗時間所局限，實驗時往往由教師開機后完成實驗參數設置、儀器平衡等操作，而學生只能做最后進樣的簡單操作來獲取數據，限制了學生對儀器本身了解的機會，也限制了學生的好奇心和創新能力的培養。

相比較而言，使用UPC2測定時，由于平衡時間短、出峰時間快，1.5 min即能完成一次樣品測試，所以在教師指導下學生可以參與儀器操作的全過程，使學生真正體會到儀器分析實驗的樂趣[9–13]。本實驗操作涉及色譜圖的疊加比較、紫外光譜圖提取及3D圖的觀察，并運用Excel軟件獲取回歸方程及精密度的計算等，這些知識的學習能為學生今后撰寫論文和制作圖文并茂的PPT打下基礎。

本實驗首次采用超高效合相色譜作為分析手段，具有操作簡單、快速高效、綠色環保等優勢。由于UPC2具有綠色環保的特點，教學中我們還將“青山綠水就是金山銀山”的環保理念貫穿于其中，使思政教育和教學過程有機結合。