乙型肝炎病毒血清學檢驗中應用CLIA和ELISA的作用及檢出率分析

程 實 劉利芹

（福建省莆田市荔城區醫院，福建 莆田 351144）

乙型肝炎為當下臨床高發性病毒性肝炎，病理機制是機體遭受乙型病毒感染，隨病情發展可致肝硬化、肝癌等嚴重并發癥形成，危及患者生命安全，需盡早診斷、及時診療[1]。實踐指出，人體免疫體系遭受乙型肝炎病毒感染后表現出特異性免疫效應，其血清學指標呈較大改變，因而對乙型肝炎病毒血清學指標展開測定有助于早期評定乙型肝炎，同時做好預后評估。CLIA（化學發光免疫分析法）、ELISA（酶聯免疫吸附法）均為檢測方法，其中ELISA檢測過程簡單、迅速，且成本較低，但亦具局限性，難以做到精確定量分析[2]。CLIA不但具有較高的檢測敏感度，且能夠迅速完成定量分析，因而在臨床得到廣泛運用，尤其是在乙型肝炎病毒相關性血清標志物測定中效果顯著。本研究取2018年1月至2020年1月86例疑似病例展開研究，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年1月于本院就診的疑似乙型肝炎病毒患者研究，統計86例。視實時熒光定量PCR檢測所得結果為金標準，分別采用CLIA、ELISA就血清學標志物（表面抗原、e抗原、e抗體及核心抗原、表面抗體）展開測定。納入病例男50例，女36例，年齡最大值、最小值分別為75歲、24歲，平均年齡為（49.51±7.26）歲。納入標準：經患者同意，并簽訂知情書；無溝通障礙；伴惡心嘔吐、全身乏力及肝區疼痛等表現。排除標準：肝腎肺器質性病變；凝血功能障礙；罹患精神疾病；檢查禁忌證。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑的選擇 選擇ELISA400全自動螺旋發光酶免一體機，儀器自身含有酶標儀；由安圖生物工程提供CLIA試劑盒，由北京萬泰生物藥業有限公司提供ELISA試劑盒。

1.2.2 檢測方法 將實時熒光定量PCR所檢驗結果視作乙型肝炎診斷金標準，具體方法：選取100 μL血清標本及試劑盒對照品，實施離心處理（1 000 r/min），時間10 min，取其上清液，然后置于血清標本100 μL震蕩搖勻后，再次實施離心操作，時間為10 min，轉速1 000 r/min，棄上清液，在沉淀物中置于血清標本（25 μL），震蕩混勻，沸水浴10 min后離心，取上清液。取PCR反應液37.6 μL，將其放置于離心管中，而后添入Taq酶與尿苷酶（0.06 μL），視作反應管，添加處理標本與對照品各2 mL，設定對照品濃度梯度，混勻后送至待檢區，采取核酸擴增儀完成PCR擴增。

CLIA：基于機體空腹狀態下抽取其5 mL外周靜脈血，離心10 min，分離血清備檢。備檢血清標本需置于聚苯乙烯試管，采取50 μL辣根過氧化酶予以標記，而后置于37 ℃環境下，1 h后采取磷酸鹽緩沖液實施沖洗，3min/次，沖洗6次。完成以上步驟后，在室溫下添加氫氧化鈉（0.1 mol/L，100 μL），靜置10 min，然后添加過氧化氫（50 μL，3%），測定發光強度，如若e抗原臨界數值超過1.00，視作陽性。

ELISA：將濃縮洗滌液使用蒸餾水亦或是去離子水20倍稀釋；按順序進行樣品對應微孔板的編號，不同板應設置陰性對照3孔，陽性對照2孔及空白對照孔，對于雙波長測定，不設空白對照孔；除空白孔外，各孔均置入20 μL樣品稀釋液，分別于對應孔中放置待測樣品亦或是陰陽性對照100 μL，緩慢振蕩混勻；以封板膜將微孔板實施封閉，置于（37±1）℃環境下溫育，時間1 h左右。而后再在每孔中添加酶標識劑（50 μL），輕輕振蕩混勻，再次封板置于（37±1）℃環境下溫育，時間半小時左右。揭掉開封板膜，采取洗板機洗滌，至少5遍，最后1遍盡可能扣干，最后加入顯色劑A、B液，均為50 μL，振蕩混勻，基于（37±1）℃避光環境下顯色半小時，加入終止液（50 μL），10 min內測定結果。

1.3 觀察指標 ①實時熒光定量PCR測定結果。②CLIA、ELISA測定結果。③統計CLIA、ELISA檢測于血清學標志物中的測定結果，如表面抗原、e抗原、e抗體及核心抗原、表面抗體。

1.4 統計學方法 借助SPSS22.0軟件對研究數據展開處理分析，計量資料用（）表示，以t檢驗。計數資料用率表示，以χ2檢驗，P＜0.05存在統計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR測定結果 經檢測發現，86疑似病例中，乙型肝炎達到52例，檢出率60.47%，其中表面抗原、e抗原、e抗體及核心抗原、表面抗體陽性檢出例數分別為8例、10例、15例、9例、10例，34例為乙型肝炎病毒感染，但其DNA為陰性。

2.2 CLIA與ELISA測定結果 結果顯示，CLIA真陽性、真陰性比為49∶29；ELISA真陽性、真陰性比為40∶32。見表1。

表1 CLIA與ELISA測定結果比較（n）

2.3 CLIA與ELISA診斷效能 相比于ELISA檢測，CLIA陰性預測值、敏感度及準確度明顯較高，對比P＜0.05；兩組陽性預測值及特異度比較P＞0.05。見表2。

表2 CLIA與ELISA診斷效能比較（%）

2.4 CLIA、ELISA檢測于血清學標志物中的測定結果 結果顯示，CLIA于血清學標志物中檢出率[94.23%（49/52）]相比于ELISA[69.23%（36/52）]明顯更高（χ2=10.883，P=0.001）。

3 討 論

乙型肝炎為高發性病毒性肝炎，患病率較高，且極易反復發作。研究表示，乙型肝炎患病早期癥狀無典型性特征，導致漏診、誤診風險增加，進而使疾病惡化，危及患者生命安全，因而找尋有效、安全的早期診斷方法尤為重要[3]。乙型肝炎病毒血清標志物測定為當下臨床鑒別、診斷乙型肝炎的重要方法，傳統標志物測定多由ELISA完成，該檢測方法具簡單、快速及價格低廉等優勢，在乙肝疾病診斷、診療中具一定作用，同時此方法于定性分析中具較好的效果，但在定量分析檢測中效果欠佳，因標本測定物濃度偶有濃度升高表現，導致鉤狀效應形成，對測定結果精準性產生影響。ELISA測定原理為借助酶顯色原理完成測定，測定精密度相對較低，當抗原亦或是抗體與酶聯結合物濃度處于較低水平時，其吸光度較低，極易出現假陰性的問題，所以，ELISA測定方法全面性不足，推廣受限。隨醫學事業發展及進步，ELISA已無法滿足現階段對乙型肝炎病毒標志物的檢測及診斷，基于此背景下，CLIA相應而生[4]。CLIA工作原理在于利用發光底物具備的發光強度特征對標志物實施測定，具較高的敏感度，可進行體內血清標志物實際狀況的直觀了解，備受臨床青睞[5]。

本次研究取2018年1月至2020年1月疑似病例實施研究，結果發現，相比于ELISA，CLIA檢測精準性、陰性預測值及敏感度明顯提高，組間對比P＜0.05，兩組特異度、陽性預測值比較P＞0.05；CLIA于血清學標志物檢出率較ELISA高，組間對比P＜0.05，提示CLIA較ELISA有著更高的檢出率，可精準檢出低濃度表面抗原，直觀反映出HBV受染進程，為后期臨床制定診療方案奠定堅實基礎[6]。不僅如此，CLIA于診療效果評價方面、測定HBV復制方面均具重大意義，考慮是CLIA在測定過程中借助科學性能較高全自動儀器及相應的試劑對血清標志物展開測定，從一定程度上避免了外在因素的感染，確保其測定穩定性。ELISA易遭受手工加樣等因素影響，使標志物顏色深淺發生變化，從而影響結果精準性。因測定方法局限性，使表面抗原測定物易呈現出假陰性狀態。有學者發現，CLIA利用順磁性微粒固相載體，其反應面積較大，能夠反復多次利用標志物，將發光時間延長，從而增強反光強度，進而對HBV受染進程清晰反映，保證CLIA測定穩定性[7-9]。焦陽[10]研究中，CLIA于表面抗原、e抗原、e抗體等標志物中檢出率較ELISA高，提示CLIA可動態化測定乙型肝炎病情的進展狀況，與本次研究中，CLIA于血清標志物檢出率94.23%（49/52）高于ELISA69.23%（36/52）近似一致，證實本研究真實可行。但限于納入樣本數量較少，關于CLIA檢測的遠期效果還需進一步論證。

綜上所述，乙型肝炎病毒血清學檢驗中采取CLIA（化學發光法）具較高的檢出率，可輔助臨床制訂診療方案，并為預后評估提供有力依據，屬理想、可行性較高的診斷方法，值得推廣及進一步運用。