苯并異噻唑啉酮酰胺衍生物的合成及其對柞蠶鏈球菌的抑菌活性評價

劉鐵成陳有嗣楊金琛劉洪麗曾 航赫英姿王立石牛雄雷

(1.遼寧省蠶業科學研究所,遼寧 鳳城 118100; 2.遼寧省蠶藥專業技術創新中心,遼寧 鳳城 118100)

柞蠶空胴病又稱軟化病,俗稱“稀屎腚”[1～5]。柞蠶空胴病致病菌為柞蠶鏈球菌,現歸屬為柞蠶腸球菌(文中按傳統習慣,均稱之為柞蠶鏈球菌)[6～8]。柞蠶鏈球菌既可通過卵面傳播,也可較長時間存活于蠶場土壤、枯落物中,引起柞蠶世代之間的水平傳播[9],還存在于20余種蠶場共生昆蟲中,可引起蠶場共生昆蟲與柞蠶的交叉傳染[10]。因此,該病害發生較為普遍,在遼寧蠶區空胴病發病率可達年均30%～40%,嚴重時可達70%以上。

對于其防治,現有防治措施主要基于嚴格的選蛾留種和采用醛類或氯制劑進行消毒,降低該病菌的卵面傳播風險[11～14]。但是,對于蠶期葉面取食感染環節的防控,零星報道見于蠶得樂、蠶康寧等,蠶農反饋其生產應用效果不盡如人意[15～16]。近年,受異噻唑啉酮類型藥劑在家蠶防病領域應用的啟發[17],開發非醛類或非氧化消毒劑類型的防治藥劑引起了我們的關注。

苯并異噻唑啉酮(Benzisothiazolinone 以下簡稱BIT)是一類作用溫和的、廣譜、高效殺菌劑[18]。前期工作表明,盡管離體條件下125 mg/L BIT處理可完全殺滅柞蠶鏈球菌,但室內養蠶試驗表明其活體防治活性不理想,使用濃度1 000 mg/L 1次用藥防效為61.2%,使用濃度500 mg/L 2次用藥防效僅為84.1%。究其原因,從藥物代謝角度分析,或許是因為BIT易溶于水,其滯留蠶體難而代謝排出易,藥效作用時間相對較短。從結構決定活性角度分析,BIT易溶于水源自其結構中親水性結構——較活潑的N-H鍵。若將其?；瘎t可提升化合物的疏水性,而疏水性改變如何影響化合物的防治活性則值得探索。因此,首先我們采用計算軟件確證設計化合物的疏水性參數LogP獲得較大范圍的調控,挑選代表性結構和原料易得的化合物進行了合成,然后在確認化合物結構基礎上,進行了衍生物的離體和活體抑菌活性測定,相關結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與器材

SQP型電子天平、THZ-82振蕩培養箱(常州國華電器有限公司)、旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)、電磁攪拌油浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司),移液器、E100顯微鏡(日本Nikon)、SC-3610低速離心機(科大創新中佳分公司)、養蟲盒、100 mm培養皿。

1.1.2 化學試劑

BIT、乙酰氯、丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、苯甲酰氯、4-氟苯甲酰氯、2-氟苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、無水吡啶均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蔗糖、蛋白胨、氯化鈉、牛肉粉、硫酸鈉、石油醚和乙酸乙酯購自沈陽國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 供試菌種及試蠶

試蠶柞蠶品種為9906,由本單位保存繁育;供試菌種柞蠶鏈球菌(Streptocouccuspernyisp.Nov.)由遼寧省蠶業科學研究所柞蠶保護研究室提供。

1.2 試驗方法

化合物的設計:利用Molinspiration Cheminformatics網絡開放軟件JME Molecular Editior,輸入擬合成化合物的結構,計算獲得化合物的正辛醇/水分配系數對數值(LogP)[19～21],作為合成選擇依據。

化合物的合成: 參照文獻,以XA1為例,制備BIT乙酰化產物[22]。 稱取10.08 g BIT(0.067 mol),置于配備攪拌磁子、溫度計和冷凝器的100 ml三口瓶,向三口瓶中加入45 ml二氯甲烷、9.0 g無水吡啶,冰水浴攪拌下,用恒壓滴加器滴加7.13 g乙酰氯(0.090 mol)與5 ml的二氯甲烷混合溶液,30 min滴加完畢,然后室溫反應1 h。反應結束將反應混合液倒入分液漏斗中,采用60 ml蒸餾水洗滌3次,有機相經無水硫酸鈉干燥,過濾,減壓蒸餾脫除溶劑,得到白色固體。按照相似方法,可制備表2中所有化合物;不同的是:反應時將原料乙酰氯變為丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、苯甲酰氯、4-氟苯甲酰氯、2-氟苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯,依次編號為XA2～11。

化合物的表征:采用WRS-1A(1B)數字熔點儀(上海精科公司產)測定化合物的熔點(溫度未校正);采用AvanceⅢ 400核磁共振儀(Bruker公司產)測定化合物的1H-NMR譜。

1.3 化合物的抑菌活性測定方法

涂平板數菌落法測定衍生物離體抑菌活性 取5 ml離心管,將3 200 μl液體培養基(組成以1 000 ml為例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、牛肉粉5 g,加蒸餾水至1 000 ml,用氫氧化鈉調節pH=9,121 ℃濕熱滅菌30 min。)中 加 入 400 μl菌 液、400 μl不 同 濃 度(500 mg/L、125 mg/L、62.50 mg/L、31.25 mg/L、15.625 mg/L)的化合物DMSO溶液,在漩渦混勻儀上混合均勻,柞蠶鏈球菌的終濃度為1.8×107CFU/ml;加樣操作在2 h內完成,以上混合液在振蕩培養箱中37 ℃、130 r/min條件下培養24 h。培養結束后將混合液分別逐級稀釋至1 000倍,用移液器取1 000倍稀釋液100 μl涂平板(固體培養基組成以1 000 ml為例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、牛肉粉5 g,加蒸餾水至1 000 ml,用氫氧化鈉調節pH=9,瓊脂20 g,121 ℃濕熱滅菌30 min。較液體培養基比含有2%瓊脂),涂菌平板置于培養箱中37 ℃下培養24 h后取出查數菌落個數?？瞻讓φ誄K即將藥液替換為無菌水。藥劑處理抑菌率計算公式:

瓊脂孔穴擴散法測定抑菌圈:制備含菌平板(固體培養基組成以1 000 ml為例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、牛肉粉5 g,加蒸餾水至1 000 ml,用氫氧化鈉調節pH=9,瓊脂15 g加熱溶解。)將培養基趁熱分裝到試管中,每試管12.5 ml,封口后121 ℃濕熱滅菌30 min。滅菌后待培養基溫度降至55 ℃時,每試管加入濃度為6.5×106CFU/ml柞蠶鏈球菌液125 μl,迅速震蕩均勻后倒入90 mm培養皿(每皿一次同時倒2只試管)冷卻后制成含菌平板,于-4 ℃中冷藏備用。用無菌打孔器在每個含菌平板上均勻打9個孔,每孔加入5 μl不同濃度(500 mg/L、1 000 mg/L)的化合物DMSO溶液,每種藥液加3孔。加藥后在室溫下擴散2 h,之后于37 ℃培養24h。培養結束后用游標卡尺測量抑菌圈直徑。空白對照CK即將藥液替換為DMSO。

圖1 BIT酰胺衍生物合成路線

化合物柞蠶體內抑菌活性測定:5月于遼寧鳳城市室外,將柞蠶品種9906的無菌種卵置于柞樹孵化,得到蟻蠶試蟲,記作試蟲A。室內,將新采摘的帶葉樹枝置于含水的海綿底座,將新培養分離提純的鏈球菌加無菌水稀釋至1×108CFU/ml后,噴施上述柞葉,待葉面菌液晾干后將1～2日齡的蟻蠶分散于樹葉,待柞蠶取食含菌樹葉48 h后得到添食柞蠶鏈球菌的蟻蠶試蟲,記作試蟲B。

藥劑處理:每處理隨機挑選試蟲B 15頭,置于單個養蟲盒中;在噴壺中將實施例2或實施例4中制備的化合物乳油加無菌水稀釋至相應濃度,噴施于柞樹葉面至布滿霧滴,0.5 h內晾干后采摘加入養蟲盒,由試蟲取食48 h以上,每處理設3次重復;每個化合物分別設置2個處理濃度(500 mg/L、1 000 mg/L)。養蟲盒中試蟲經過一次藥劑處理之后,放置不經藥物處理的新鮮柞樹葉飼養至四齡期。期間,跟蹤標記,清除蠶沙和雜物,適時添食新鮮柞樹葉,及時剔除發病或死亡試蠶,調查各處理剩余蠶數,累計空胴病發病或死亡蠶總數N,計算發病率。

對照處理:在單個養蟲盒放置試蟲B 15頭,采用不經藥劑處理的新鮮柞樹葉喂養,設3次重復,作為空胴病毒對照CK-D;在養蟲盒正常飼養試蟲A 15頭,采用不經藥劑處理的新鮮柞樹葉喂養,3次重復,作為空胴病空白對照CK-0。跟蹤標記,清除蠶沙和雜物,適時添食新鮮柞樹葉,及時剔除發病或死亡試蠶,飼養至四齡期,調查各處理剩余蠶數,累計空胴病發病或死亡蠶總數N。

空胴病發病率、防效計算公式如下:

2 結果與討論

2.1 BIT酰胺衍生物的設計合成與結構表征

2.1.1 BIT酰胺衍生物的設計合成

采用JME Molecular Editior計算得到的化合物參數如表1所示,可見,對于取代基R為烷基,隨著碳鏈數從1增長至8,擬合成化合物LogP值以每增加1個碳數增加～0.5遞增,且當碳數超過7時,LogP數值大于5;對于R基為取代苯基時,擬合成化合物LogP值均介于3.32～4.17。文獻表明藥物LogP高于5時口服生物利用度很低[21],因此,取代基R為烷基鏈時,選取鏈長碳數為1～6進行合成;取代基R為表中芳基時,理論上可悉數合成,實際合成時兼顧原料的可及性(化合物No.14,15因合成原料昂貴而舍棄)。

表1 擬合成化合物的LogP計算值

2.1.2 BIT酰胺衍生物的表征

按照文獻方法,合成BIT酰胺衍生物如表2所示,其熔點熔程均介于2～5 ℃,說明化合物純度較高,1H-NMR譜分析表明,所得化合物的氫原子種類和數量均與目標設計理論結構相符[22]。這說明,所得化合物即為目標設計結構。

表2 供試BIT酰胺衍生物(XA1～11)

2.2 BIT酰胺衍生物的生物活性評價

2.2.1 BIT酰胺衍生物抑菌率涂平板數菌落數法測定結果

涂平板數菌落法定量測定了BIT酰胺衍生物對柞蠶鏈球菌的抑菌率,結果表明(表3),化合物使用濃度不低于62.5 mg/L時, XA1～11的抑菌效果均超過99%,無明顯差異。當化合物濃度為31.25 mg/L時, XA1～4,XA6～8抑菌活性可達到96%以上,其中XA2、XA6,XA7、XA8均達到99%,與母體化合物BIT相當,XA5,XA9～11四個化合物抑菌活性低于95%。結果說明: BIT酰胺衍生物抑菌活性總體低于母體化合物,且隨著濃度降低,抑菌活性出現分化。

表3 由涂平板數菌落法測得BIT酰胺衍生物的抑菌活性

2.2.2 BIT酰胺衍生物抑菌圈試驗結果

設定處理濃度為500 、1 000 mg/L,采用瓊脂孔穴擴散法測定了BIT酰胺衍生物的抑菌活性,結果(表4)表明,當處理濃度為500 mg/L時,XA1～XA5,即取代基R為烷基時,衍生物抑菌圈可測得,其中XA1抑菌圈直徑最大,為9.3 mm;XA7～11,即取代基R為芳基時,其抑菌圈未測得。當處理濃度增加至1 000 mg/L時,除了XA8外均存在抑菌圈,衍生物中XA1抑菌圈直徑最大,為12.20 mm,與母體化合物BIT抑菌圈數值(12.56 mm)最為接近。

表4 由瓊脂孔穴擴散法測得BIT酰胺衍生物的抑菌活性

2.2.3 BIT酰胺衍生物柞蠶體內防治活性測定結果

由表5數據可知,處理濃度為500 mg/L時,BIT酰胺類衍生物的治療活性較低,化合物XA3防效最大,為10.7%,遠低于對照母體化合物的防治活性59.1%。當使用濃度為 1 000 mg/L時,化合物的防治活性有所增加,但總體活性不足20%,遠不及相同濃度下母體化合物BIT的防效(61%)。

表5 BIT酰胺衍生物在柞蠶體內空胴病防治活性比較

3 結論

采用Molinspiration Cheminformatics網絡開放軟件JME Molecular Editior輔助設計,合成了11個BIT酰胺衍生物,其中取代R基為直鏈烷烴基6個,取代芳香基5個,其結構經熔點測試和1H-NMR分析確認。

涂平板數菌落數法測定結果表明,BIT酰胺衍生物較之BIT抑菌活性降低:要達到99%以上抑菌活性(對柞蠶鏈球菌有預防作用),使用濃度應達到62.5 mg/L。瓊脂孔穴擴散法結果表明,處理濃度較低(500 mg/L)時,衍生物的抑菌圈較小或未測得,抑菌活性顯著弱于BIT;處理濃度提高至1 000 mg/L,衍生物抑菌圈有所增加,總體低于母體化合物,僅衍生物XA1抑菌活性最接近母體化合物。初步的活體抑菌實驗表明,不同處理濃度(500、1 000 mg/L)下,BIT酰胺衍生物的空胴病治療活性均不及母體化合物BIT。說明BIT酰胺化改造不能提升其對柞蠶鏈球菌的防治活性。為提高抑菌活性特別是柞蠶體內的抑菌活性,進一步的BIT衍生改造不但要考慮疏水性問題,還要考慮化合物的電性等其他內在影響因素。