BMI-1和MMP-3基因多態性與漢族群體乳腺癌易感性的關聯分析

張明龍 王秀華 呂 瑩 李鵬輝 劉 丹 梅慶步 劉萬全 鄭立紅▲

1.齊齊哈爾醫學院遺傳學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院生物技術實驗中心，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

乳腺癌是常見的多基因遺傳的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的健康。基于全基因組關聯分析（genome wide association study，GWAS）的研究，乳腺癌易感基因譜正不斷完善。目前已經確定了150 多個與乳腺癌風險有關的基因位點[1]。然而，乳腺癌發病的靶基因和具體機制仍然不明確。因此，對不同群體的乳腺癌易感基因的篩查對乳腺癌患者的早期診斷和個體化治療至關重要。B 細胞特異性白血病病毒插入位點-1（Bcell-specific moloney leukemia virus insection site 1，BMI-1）基因作為原癌基因，可以通過編碼多梳蛋白抑制抑癌基因的活性，在腫瘤細胞發生發展和腫瘤干細胞的維持上起到關鍵作用[2]，BMI-1 基因可以通過核轉汞因大（nudear factor κB，NF-κB）/金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）通路增強腫瘤細胞的轉移和侵襲能力[3]。基質MMP-3 基因可編碼基質溶解酶，與腫瘤的血管侵襲和淋巴轉移有密切關系[4]。本研究選取BMI-1 基因rs1042059、rs201024480以及MMP-3 基因rs3025058 位點，對黑龍江地區漢族女性乳腺癌患者進行易感基因篩查，評估上述基因與乳腺癌易感性的關聯，以期為乳腺癌患者的診治提供遺傳學基礎數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2018年7月黑龍江省齊齊哈爾市和大慶市（齊齊哈爾醫學院附屬第二、三醫院、齊齊哈爾建華醫院和大慶油田總醫院）524 例漢族女性乳腺癌患者作為病例組。乳腺癌患者納入標準：經過病理診斷確診。排除標準：患有其他癌癥和接受過放療或化療，患者彼此之間無親屬關系。選取同期進行健康體檢的518 例健康體檢者作為對照組。對照組納入標準：健康個體。排除標準：腫瘤家族史、腫瘤家族史和癌前病變者，如宮頸炎、疣和癌前病變。本研究通過醫院醫學倫理委員會審核批準，并遵循知情同意原則。

1.2 方法

1.2.1 樣本信息和臨床資料

本研究所有樣本基本信息和臨床資料信息均同步獲取于各醫院。乳腺癌樣本的基本信息包括年齡和月經初潮年齡，臨床資料包括絕經年齡、腫瘤家族史、腫瘤分期（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期）、腫瘤大小（T1～T4）[3]和有無淋巴結轉移情況。對照組只收集基本信息（年齡和月經初潮年齡）。

1.2.2 DNA 提取與基因分型

采用人類基因組DNA 提取試劑盒（北京艾德萊）對上述樣本的基因組DNA 進行提取，所得DNA于-80℃保存。采用微量分光光度計（北京奧盛）對DNA樣本進行定量。采用PCR-LDR 技術（華大蛋白）對BMI-1 基因外顯子區域的2 個功能性單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點：包括rs1042059（18Cys＞Tyr）、rs201024480（310Ser＞Asn）和MMP-3 基因啟動區域的rs3025058 位點進行基因分型，引物及探針的合成遵循基因源序列。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 和Haploview 4.2 統計學軟件進行數據分析，計量資料使用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗分析兩組間的計量資料信息；計數資料采用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，擬合優度χ2檢驗Hardy-Weinberg 平衡；通過對混雜因素進行校正以后，采用非條件性logistic 回歸分析法評估乳腺癌的發病風險，風險值 （OR）和95%置信區間（CI）表示患病風險。采用HaploView 4.2進行連鎖分析和單倍型分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本基本特征和比較分析

病例組和對照組的基本信息和臨床資料信息見表1。通過進行組間比較，兩組的年齡、月經初潮年齡和腫瘤家族史比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。因此，在后續的logistic 回歸和單倍型分析中，需要進行校正。病例組中，5.95%有腫瘤家族史，且絕經年齡平均在50 歲左右。腫瘤大小T1、T2、T3和T4分別占49.69%，42.77%，3.77%和3.77%；腫瘤分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期分別占4.63%、49.27%和46.10%；淋巴結呈陽性者占42.47%。

表1 樣本基本特征和比較分析

2.2 平衡性檢驗和連鎖分析

Hardy-Weinberg 平衡檢測結果顯示，3 個多態性位點在兩組間的基因型分布觀察值與期望值無顯著性差異（P＞0.05），提示該研究群體具有良好的遺傳代表性。連鎖分析結果顯示，BMI-1 基因rs201024480、rs1042059 位點之間不存在連鎖遺傳，可構成單倍型進行后續分析。

2.3 BMI-1 基因多態性與乳腺癌易感性的關聯分析

BMI-1 基因rs201024480 和rs1042059 屬于低外顯率突變位點，突變型等位基因A 和G 在群體里頻率極低，雜合子基因型GA 和AG 基因型頻率同樣很低，且等位基因和基因型頻率分布在兩組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。鑒于兩位點的突變純合子較少，本研究在顯性模型（AA/AG+GG）和加性遺傳模型（AA/AG/GG）下對乳腺癌的風險進行預測。在校正年齡、月經初潮年齡和腫瘤家族史因素后，rs201024480、rs1042059 的多態性與乳腺癌的發病風險無相關性（OR=0.94，1.03；95%CI=0.36～2.42，0.27～3.97；P=0.892，0.965）。同樣，由兩位點組成的單倍型G-A 和A-A 與乳腺癌發病風險無相關性（OR=1.08，95%CI=0.49～2.39，P=0.842）。BMI-1 基因多態性與乳腺癌易感性的關聯分析見表2。

表2 BMI-1 基因兩個位點基因多態性在與乳腺癌發病風險的關聯分析

2.4 MMP-3 基因多態性與乳腺癌易感性的關聯分析

兩組間MMP-3 基因rs3025058 位點多態性的比較，差異有統計學意義（P＜0.05），突變純合型5A5A攜帶者患乳腺癌的風險較對照組高約1.51 倍。在校正年齡、月經初潮年齡和腫瘤家族史因素后，顯性模型（AA/AG+GG）下，兩組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05，OR=1.51，95%CI=1.17～1.94，P=0.001）。加性模型（AA/AG/GG）下，兩組間比較，差異無統計學意義（Pchi＜0.05，OR=1.48，95%CI=1.16～1.91，Plog=0.002）。MMP-3 基因多態性與乳腺癌易感性的關聯分析見表3。

表3 MMP-3 基因多態性在與乳腺癌發病風險的關聯分析

3 討論

BMI-1 基因作為編碼多梳蛋白抑制復合體的一部分，參與維持復合體的完整性，在組蛋白H2A 的泛素化修飾中起關鍵作用，參與并影響細胞增殖、DNA修復、凋亡和衰老等多個過程[5]。其過表達與腫瘤的侵襲性、轉移性以及放化療敏感性和預后密切相關[6]，在乳腺癌、原發性肝細胞癌、胃癌、卵巢癌、頭頸部癌、胰腺癌和肺癌等多種癌癥中均可見過表達。本研究選取位于BMI-1 基因外顯子區域的2 個SNP 位點：rs1042059（18Cys＞Tyr）和rs201024480（310Ser＞Asn），其中rs1042059 位置的多態性影響了組蛋白的泛素化修飾[7]。許多研究[8-10]表明，BMI-1 可以通過調控NF-κB/MMP 和PTEN/P13K/Akt 通路增強腫瘤細胞的轉移和侵襲能力。本研究結果顯示，BMI-1 基因rs1042059、rs201024480 位點與乳腺癌的發病風險不具有相關性。其原因可能是本研究選取的基因位點數量有限。因此，并不能從總體的累加效應水平或者基因間的交互效應的角度去確定該基因是否可以被排除做為乳腺癌的候選易感基因。BMI-1 基因多態性與漢族女性乳腺癌易感性的關系尚需進一步驗證，需要更多基因位點、更大樣本和精心設計的實驗研究。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族是一類分泌型鋅依賴型內肽酶，參與細胞外基質和基底膜的降解、腫瘤的增殖、血管生成、侵襲和轉移過程[11-12]。MMP-3 基因可通過降解纖連蛋白和膠原纖維參與細胞外基質的調節，其過表達與包括乳腺癌在內的各種腫瘤的轉移和生長有關[13]。有關MMP 的基因多態性與乳腺癌的關聯分析研究較多[14-16]，其中MMP-3 基因中研究較多的是位于啟動子區域-1171的6A/5A 位點，即rs3025058。該位點在不同族群中的多態性差異較明顯，其多態性與乳腺癌易感性的關聯也在不同族群中存在明顯差異[13，17-18]。鑒于此，本研究對黑龍江地區漢族女性乳腺癌患者與MMP-3 基因的易感性進行檢測和評估。本研究結果顯示，MMP-3 rs3025058 基因多態性與乳腺癌發病風險存在相關性（P＞0.05），攜帶5A 等位基因和5A5A 基因型群體患乳腺癌風險比對照組提高約1.5 倍。并且，已有研究[19]證明5A 等位基因比野生型6A 具有更高的轉錄活性，由此可見，5A 等位基因更有利于乳腺癌的發生發展。

基于以上研究結果和討論，本研究仍存在一些局限性。第一，單純的病例-對照研究并不能從生物學上完全證明乳腺癌發病和多基因遺傳的具體關系，仍然依靠于功能學的相關深入研究；第二，明確靶基因是否可作為乳腺癌易感基因，單一SNP 位點的檢測是不足以證明的，后續將進一步篩選更多位點，從多個位點所構成的單倍型、累加效應和交互作用等角度分析關聯性；第三，本研究群體較為局限，只限于黑龍江省地區漢族女性群體，并不能代表中華地區漢族群體總體關聯水平，后續應對不同群體的關聯研究進行匯總和meta 分析，以排除多群體混淆的干擾。

綜上所述，MMP-3 基因rs3025058 位點多態性與乳腺癌發病風險具有相關性；可為本地區乳腺癌患者的早期篩查、診斷及個體化治療提供參考依據。