豚草粗提物提取及對楊樹爛皮病抑菌效果比較

紀純陽

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213)

豚草Ambrosiaartemisiifolia又名艾葉破布草，屬菊科、豚草屬，1年生草本植物。它被列為世界公認的危害性雜草，在我國各地均有分布[1]。許多學者對豚草進行了各方面研究，主要包括形態學、分類學、生理生態學、種群生態學等[2]。其含有豐富的倍半萜內酯類化合物，具有化感、殺蟲抑菌、滅螺等多種生物活性[3-4]。

楊樹爛皮病又稱腐爛病，病原有性階段為污黑腐皮殼菌Valsasordida，無性階段為金黃殼囊孢菌Cytosporachrysosperma[5]。楊樹爛皮病是危害嚴重的枝干病害，是潛伏侵染性病害，通常分為干腐型和枝枯型。當遇到凍害、水澇、干旱及日灼等惡劣環境，或者受移植苗木或修剪強度大等因素影響時，樹木不易恢復生機而導致病害迅速發生，輕度會影響到樹木生長，出現枯枝、枯干、放葉晚、葉片變小等病狀，嚴重時造成樹木大面積死亡[5-6]。楊樹病害的防治常采用化學農藥，而傳統的化學農藥存在污染環境和產生抗藥性等問題，人們越來越傾向于從天然物質中尋找更安全、更高效的活性物質以開發新型農藥。從植物中尋找抑菌活性物質是開發、研制無公害新型抑菌劑的重要途徑之一[7]。

豚草作為一種新型植物源農藥的植物資源，在農林漁業有一定的應用，但如何從豚草的葉片中提取抑菌活性物質是應用的前提條件。本文研究了豚草粗提物的提取工藝及對楊樹爛皮病林間防治效果比較，這在省內未見報道，以期為新型植物源農藥的研究提供前期的基礎，為推進植物源農藥在林木病蟲害防治中的應用與推廣提供依據。

1 供試材料

1.1 試驗材料

豚草Ambrosiaartemisiifolia，采自遼寧省蓋州市高麗城和西海等地區。

試驗地設在國有新民機械化林場，4年生108楊栽植密度2.5 m×5 m，自然發生楊樹爛皮病。

1.2 供試藥劑

50%多菌靈(江蘇藍豐生物化工股份有限公司)，3%甲基硫菌靈(山西北方果康寶農藥有限公司)，果緣高(山西省農科院棉花所三聯農化實驗廠)。

2 試驗方法

2.1 豚草葉片的預處理

將采集的豚草葉片用清水洗凈，放于通風陰涼處陰干，再用50 ℃烘箱烘干至恒重后，用中藥材粉碎機粉碎1 min，稱重分裝于棕色試劑瓶中，放于陰涼處保存備用[8-9]。

2.2 豚草粗提物提取方法

選取了冷浸、溫浸、索氏、超聲波、冷浸-超聲波聯合和溫浸-超聲波聯合6種提取方法提取豚草粗提物[10-15]。

2.2.1 冷浸法

稱取豚草粉末10 g裝入250 mL燒杯內，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鮮膜將燒杯口密封，室溫浸泡24 h，并攪拌3～4次。

2.2.2 溫浸法

稱取豚草粉末10 g裝入250 mL的燒杯內，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鮮膜將燒杯口密封好，放在恒溫水浴鍋(40 ℃)24 h，并攪拌3～4次。

2.2.3 索氏提取法

稱取豚草粉末10 g，用濾紙包成封閉小包，務必封好口不讓粉末漏出，將小包置于索氏提取器中，加入80%乙醇200 mL，90 ℃水浴加熱約10 h，讓小紙包完全浸透，發生虹吸現象后，停止提取。

2.2.4 超聲波提取法

稱取豚草粉末10 g裝入250 mL錐形瓶中，加入80%的乙醇溶液200 mL，用保鮮膜和橡皮筋密封，置于超聲波振蕩50 min，并攪拌2次。

2.2.5 冷浸-超聲聯合提取法

稱取豚草粉末10 g裝入250 mL錐形瓶中，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鮮膜和橡皮筋密封，室溫放置2 h后超聲波振蕩50 min，再室溫放置22 h，并攪拌3～4次。

2.2.6 溫浸-超聲聯合提取法

稱取豚草粉末10 g置于250 mL錐形瓶中，加入80%乙醇200 mL，用保鮮膜和橡皮筋密封，40 ℃水浴2 h后超聲波振蕩50 min，之后再水浴22 h，并攪拌3～4次。

2.2.7 提取物的析出

以上6種提取方法設置3次重復，各組提取液經真空抽濾后用旋轉蒸發器(40 ℃，80～120 r·min-1)減壓濃縮至無溶劑滴出，即得膏狀粗提物，再將其轉移至小燒杯或平皿中，必要時可使用10%的吐溫溶液助溶，于40 ℃烘箱中烘干稱重，放入4 ℃冰箱中保存[16]。計算提取率，確定最佳的提取方法。

2.3 豚草粗提物提取條件的優化

對最佳提取方法中的提取條件因子進行優化，選擇4因素3水平進行正交試驗設計(表1)，設置3次重復。各組提取液經真空抽濾后用旋轉蒸發器(40 ℃，80～120 r·min-1)減壓濃縮至無溶劑滴出，即得膏狀粗提物，再將其轉移至小燒杯或平皿中，必要時可使用10%的吐溫溶液助溶，于40 ℃烘箱中烘干稱重，計算提取率，確定最優的提取條件[17-19]。

表1 正交試驗因素和水平

2.4 豚草粗提物對楊樹爛皮病的林間防治試驗

遼寧省新民市國有機械化林場4年生108楊，自然發生楊樹爛皮病。共選擇4種藥劑，豚草提取物(40 mg·mL-1)、果緣高(原液)、多菌靈(500倍稀釋液)、甲基硫菌靈(5倍稀釋液)，對4年生108楊楊樹爛皮病進行了林間防治試驗。因病斑面積大，采用刮皮后涂抹和直接涂抹2種方法進行防治，選取3個連續區域(3次重復)，隔7 d再涂抹1次，40 d后進行病害調查。根據爛皮病病斑是否外擴統計病害防治情況[20-21]。

2.5 統計方法

采用DPS18.10高級版軟件LSD法進行數據分析，計算粗提物提取率和林間防治病株減退率[22-23]。公式如下：

3 結果與分析

3.1 豚草粗提物提取方法

選取冷浸、溫浸、索氏、超聲波、冷浸-超聲波聯合及溫浸-超聲波聯合6種提取方法提取豚草中抑菌活性物質，以提取物干重為測量指標，計算提取率。6種提取方法提取率依次為：溫浸-超聲波法(18.93%)>冷浸-超聲波法(17.14%)>超聲波法(16.99%)>索氏法(16.93%)>溫浸法(15.25%)>冷浸法(14.10%)，溫浸-超聲波法除了與冷浸-超聲波法差異不顯著外，與其它4種提取方法存在顯著性差異(P<0.05)。因此豚草粗提物最佳提取方法為溫浸-超聲聯合提取法，提取率達到18.93%。

3.2 豚草提取物提取條件的優化

選擇溫浸-超聲波聯合法提取豚草粗提物，對提取過程中影響顯著的4個因素各選3個水平進行正交試驗，結果見表2。

表2 豚草粗提物提取條件正交試驗結果

通過正交試驗確定最佳的提取條件為第5組A2B2C3D1組合，即超聲波時間45 min、乙醇體積分數75%、料液比1∶20 g·mL-1、40 ℃水浴24 h。其中超聲波時間和乙醇體積分數兩個因素對豚草粗提物的提取率影響顯著。在最佳提取工藝下，豚草粗提物的提取率達到20.35%。

3.3 豚草粗提物與3種藥劑對楊樹爛皮病的林間防治效果

從表3可以看出，刮皮后涂藥處理的病株減退率依次是豚草粗提物>多菌靈>果緣高>甲基硫菌靈，直接涂抹病株減退率依次是多菌靈>豚草粗提物>甲基硫菌靈>果緣高，由此可見刮皮后涂藥處理比直接涂抹防治效果更佳，豚草粗提物與多菌靈的防治效果優于其他2種藥劑，說明豚草粗提物對楊樹爛皮病有較好的防治作用。

表3 四種藥劑對楊樹爛皮病的林間防治試驗效果比較

4 結論與討論

本文對豚草粗提物的提取工藝進行優化，通過試驗確定了最佳的提取方法為溫浸-超聲波聯合提取法，提取條件為超聲波45 min、75%乙醇溶液、料液比1∶20 g·mL-1、40 ℃水浴24 h，提取率為20.35%。

為了更好地將豚草提取物質應用于林業病害的防治中，開展了豚草粗提物與3種藥劑對楊樹爛皮病的林間防治效果比較試驗。采用刮皮后涂抹防治效果更佳，豚草粗提物與多菌靈的防治效果優于其他2種藥劑，證實豚草粗提物對楊樹爛皮病有較好的防治作用。本項研究在豚草粗提物林間防治楊樹爛皮病方面雖然達到了一定的效果，但林間防治還存在防治藥劑的選擇、防治時間、藥劑使用量和防治效果統計分析難度大等問題，本試驗僅開展了小樣本的林間防治，在確定試驗效果后可再開展大規模的防治試驗。

本研究為進一步開發林業用植物源殺菌劑提供理論依據，為確定用于生產和防治工作的新型植物源農藥提供前期研究基礎，使豚草這種入侵植物變廢為寶，對推進無公害農藥的研究和應用有著重大的意義。