歐洲黑楊高生長相關基因PnIAA9的克隆及進化分析

楊成超

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213)

楊樹Populusspp.屬于被子植物門Angiosperms雙子葉植物綱Dicots楊柳科Salicaceae楊屬，是多年生木本植物，無居間分生組織。它分布廣泛，易繁殖，是人工用材林、生態防護林及四旁綠化的重要樹種，具有重要的經濟和生態價值。樹高是與楊樹木材產量密切相關的重要性狀之一。由于多年生楊樹樹體高大，樹高不易精確測定，故1年生苗的高生長研究在楊樹高生長形態建成研究中占據重要地位[1]。

高等植物通過調節頂端分生組織和側生分生組織的活性建立地上株型系統，分生組織的活性受環境信號、發育階段和遺傳因素的綜合調控，植物激素參與這些信號的整合。頂端優勢是植物分枝調控的核心問題，而生長素對頂端優勢的形成和維持發揮關鍵作用。Auxin/indole-3-acetic acid(Aux/IAA)蛋白是調節許多對生長素反應現象的轉錄調節因子，大部分Aux/IAA的功能已經通過擬南芥獲得性突變體確定了。Aux/IAA和ARF轉錄因子是植物中生長素響應的關鍵調節因子，楊樹基因組中總計有35個Aux/IAA和39個ARF基因被識別[2]。Aux/IAA轉錄因子IAA9的功能涉及果實發育、葉片形態建成[3]和毛白楊P.tomentosa次生木質部發育[4]。沈韻[5]研究了毛白楊的IAA9在木質部、韌皮部、莖、根中的差異表達。目前未見到從歐洲黑楊P.nigra中克隆IAA9的報道。

為探討楊樹苗期高生長與內源IAA的關系，從分子角度研究高生長形態建成，在黑楊派樹種高生長定位觀測[1]和內源IAA及ABA含量分析[6]基礎上，本文以歐洲黑楊為材料，采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術克隆了與高生長密切相關、與葉片發育有關的生長素基因家族的PnIAA9，并進行了楊樹Aux/IAA基因家族的進化分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料

4月上旬，采用硬枝扦插技術，在花盆(直徑33 cm，高26 cm，底徑20 cm)內扦插1段18 cm長歐洲黑楊1年生莖段。花盆中土壤為沙壤土與腐殖土混合物(體積比為3∶1)。溫室溫度控制范圍15～25 ℃，苗木常規水肥管理。7月中旬，剪取歐洲黑楊莖尖并置于凍存管中，立即投入液氮，取出后-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑

RNA 提取使用Trizol試劑(Invitrogen,USA)，ExTaq DNA Polymerase(TaKaRa，Japan)，RQ-DNase(Promega，USA)，RNase Inhibitor(TaKaRa，Japan)，MM-LV反轉錄試劑盒(Promega，USA)，dNTP(華綠源生物，中國)，pGEM-T easy試劑盒(Promega，USA)，PCR擴增產物回收和純化試劑盒、質粒提取試劑盒(AxyGen，USA)，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)，引物合成(北京奧科生物，中國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 Total RNA提取及檢測

按照Trizol試劑盒說明書提取歐洲黑楊總 RNA，使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent RNA 6000 Nano Kit)檢測總 RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片斷大小。樣本的純度使用紫外分光光度計NanoDropTM進行測定。

1.2.2 基因的克隆

RACE引物設計：根據PopulusDB EST數據庫中IAA9序列設計RACE引物如下：3IAA9：5′-CCCTTTGCATCCCTCAAATGATGGTC-3′；5IAA9：5′-GCGGAGCTGTTACGAAGTGGTCTGGT-3′。其中，3IAA9從基因的3′ 端克隆；5IAA9從基因的5′ 端克隆。

歐洲黑楊IAA9基因的克隆采用SMART RACE技術，詳細過程參照Clontech生物公司生產的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書。

反轉錄：分別向標記5′和3′ 的200 μL PCR反應管內加2 μL RNA；向標記3′ 的PCR反應管內加1 μL 3′RACE CDS，1 μL Extension Buffer，1 μL H2O混勻后72 ℃溫浴2 min，立即冰浴冷卻；向標記5′ PCR反應管內加1 μL 5′ RACE CDS，1 μL Extension Buffer，1 μL 5′ RACE SMART Oligo混勻后72 ℃溫浴2 min，立即冰浴冷卻；分別向上述PCR反應管內加1μL DTT，2μL 5×First strand buffer，1 μL dNTP和1 μL SuperScriptase II，混勻后42 ℃溫浴60 min，48 ℃溫浴30 min。反轉錄完畢，分別向各反應管內加100 μL滅菌水，混勻后-20 ℃保存。

3′ RACE/5′ RACE擴增：分別向標記5′和3′兩個200 μL PCR反應管內加2.5μL相應的第一鏈合成產物；向5′ 標記的PCR反應管內分別加1μL ycc5IAA92(10 μmol·L-1)引物，向3′ 標記的PCR反應管內分別加1 μL ycc3IAA92(10 μmol·L-1)引物；向上述PCR反應管內分別加47.5 μL按照說明書配制的反應混合液，混勻后立即按照下列反應體系進行PCR反應：先96 ℃預變性1 min，然后 96 ℃ 10 s、72 ℃ 2 min進行10個循環，再96 ℃ 10 s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min 15個循環。反應完畢后，取5 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段的特異性和大小。

擴增產物切膠純化：使用AxyGen公司生產的瓊脂糖凝膠及PCR產物純化試劑盒，對PCR擴增產物切膠純化。

T-載體連接、轉化和測序：將凝膠純化的目的片段按照操作說明與pGEM-T Easy載體連接，連接產物轉化E.coliDH5α 感受態細胞。在含有IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)和X-gal(β-半乳糖苷酶)的LB/Amp平板篩選陽性植株，提出質粒并測序。測序引物是M13F和M13R，測序結果拼接后得基因的全長序列。

1.2.3 基因IAA9序列分析及進化樹構建

應用DNAMAN軟件對克隆的PnIAA9進行序列分析，應用美國國立生物技術信息中心(NCBI)Conserved Domains分析PnIAA9結構域，應用Culusterx軟件進行氨基酸多序列比對。在文獻分析基礎上，從NCBI找到楊樹中Aux/IAA家族基因并下載序列，應用MEGA7軟件，通過NJ(Neighbor-joining)法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 歐洲黑楊IAA9基因克隆

提取的歐洲黑楊莖尖的總RNA質量參數為OD260∶OD280=1.98，OD230∶OD260=2.01。總RNA 28S/18S條帶亮度比值大于2，表明提取的總RNA經RNase-free DNase處理后完整性較好，沒有降解和雜質污染現象。

圖1為IAA9基因的5′ RACE和3′ RACE擴增圖譜，從圖1可以看出，IAA9 5′ RACE 克隆特異性比較好，為單一條帶擴增的產物，大小為900 bp左右。而3′ RACE克隆特異性比較差，被擴增的產物大小為700 bp左右的特異條帶，此外在1.0 Kb有一條非特異擴增條帶。通過切膠回收5′ RACE產物和3′ RACE產物700 bp左右的條帶，連接T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，經測序分析，獲得IAA9基因5′ 和3′ RACE序列。去掉重復序列，經拼接得到IAA9全長，命名為PnIAA9，長度為1 786 bp。全長DNA序列和氨基酸序列見圖2。

注：M為DL2000 Plus Marker；1為3′ RACE；2為5′ RACE。

圖2 PnIAA9全長DNA序列和氨基酸序列

把PnIAA9 full length數據在NCBI中做Blast，得到的100個結果中，前14個結果的Per.Ident大于90%，其中第一位的P.deltoides值達到99.73%；排第2位的auxin-responsive proteinIAA9[P.trichocarpa]Per.Ident達到99.18%；排前11位的都是楊樹的IAA9。

2.2 PnIAA9序列分析

利用DNAMAN軟件進行分析，該基因編碼一條由365個氨基酸組成的多肽鏈(圖3)。

圖3 PnIAA9全長序列的開放閱讀框

PnIAA9結構域分析結果表明，其屬于Aux/IAA家族。氨基酸序列特異點區間212～357，E-value= 6.19e-110，E-value數值小說明結果很有意義。Aux/IAA基因的轉錄是由植物激素生長素快速誘導的，該家族的一些成員較長，并包含一個N末端DNA結合域。

選擇PnIAA9和從NCBI下載的毛果楊IAA9、IAA20、IAA32、IAA33氨基酸序列，進行氨基酸多序列比對，結果見圖4。典型的Aux/IAA蛋白具有4個保守結構域，分別稱為Domain I、II、III和IV[7]。Domain I、II位于氨基端(N端)，而Domain III和IV位于羧基端(C端)。Domain II是Aux/IAA蛋白被泛素化降解的靶位點，其核心序列VGWPP是經典蛋白降解序列。PnIAA9、IAA9和IAA20都具有VGWPP序列(圖4中黑色方框)，說明PnIAA9等3個蛋白易受到生長素的降解，是短命蛋白。

圖4 PnIAA9等氨基酸多序列比對結果

2.3 PnIAA9 與楊樹Aux/IAA進化樹構建

綜合文獻分析結果，在NCBI上找到并下載18個楊樹Aux/IAA生長素響應蛋白序列，多數屬于毛果楊P.trichocarpa基因組，與從歐洲黑楊中克隆的PnIAA9構建進化樹，結果見圖5。

由圖5可知，PnIAA9與毛果楊的IAA9同源性最高，與毛果楊的IAA33基因序列相似度最低，進化關系最遠。

圖5 PnIAA9與18個楊樹Aux/IAA進化樹構建

3 結論與討論

楊樹苗高由節間長和節間數構成，由于其葉互生，節間數量與葉片的數量密切相關。在枝條長度相等時，美洲黑楊節間相對較長但節間數量少，歐洲黑楊節間相對較短但數量較多。通過克隆歐洲黑楊節間數量基因，再通過轉基因技術轉化到美洲黑楊，可能培育出節間長且節間數量多的速生樹種。

一般認為，IAA和葉的起始有關[8]，阻斷生長素的運輸會阻止葉的起始，在擬南芥的生長素運輸缺陷突變體中可以觀察到這個現象[9]。高紅兵等[10]應用GC-MS-SIM技術測定了毛白楊休眠芽中IAA和ABA含量，楊成超等[6]研究了IAA與ABA含量的比值與3個黑楊派楊樹苗高的關系，結果表明苗高月增量與頂芽的IAA/ABA呈顯著正相關。目前，在擬南芥中已經有通過Aux/IAA9調控來調節擬南芥生長的研究[11]。

本研究從歐洲黑楊莖尖中克隆的PnIAA9基因長度為1 786 bp，編碼365個氨基酸，并進行楊樹Aux/IAA家族的進化分析。將來可以利用基因編輯等技術提高或降低頂端分生組織IAA的含量來調控內源IAA/ABA含量的比值，也可以通過對IAA的調控來控制節間數量的多少實現苗高性狀的分子調控和遺傳改良，從而為培育矮化園藝植物和超級速生楊樹打下基礎。