HPLC對頭孢克肟干混懸劑的含量測定研究

楊 佳

濟源市婦幼保健院(河南 濟源 459000)

頭孢克肟為口服頭孢類抗菌藥物,對細菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶有高度穩(wěn)定性。該藥物殺菌力較強且抗菌譜廣,具有高療效及組織滲透性、有效濃度持續(xù)時間較長、用量小、不良反應(yīng)發(fā)生率低等特點[1-2]。體外研究表明[3],高出成人劑量100多倍時不會使細胞染色體突變及損傷。故該藥安全性較高,可用于兒童抗感染治療,且為較好抗感染治療轉(zhuǎn)換藥。由于頭孢克肟制劑內(nèi)有較多講解產(chǎn)物,受到其余輔料感染,其含量測定不適宜用紫外法[4]。為此,本研究探討了HPLC對頭孢克肟干混懸劑的含量測定,報道如下。

1 儀器與方法

1.1儀器與試藥 儀器:高效液相色譜儀(安捷倫,型號:1100型)、紫外檢測器(型號:G1314A型)、進樣器(77251I型)、電子天平(AE-104N型)。

試藥:頭孢克肟對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:130503-200502)、乙腈、蒸餾水、頭孢克肟干混懸劑(哈爾濱凱程制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字:H20060266,規(guī)格:1g:50mg)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱,設(shè)置150×4.6mm,5μm；流動相氫氧化四丁胺-乙腈,25ml的10%氫氧化四丁胺溶液稀釋至1000ml,pH用磷酸調(diào)節(jié)為7.0,乙腈為3∶1；流速為1.2ml/min；柱溫為40℃；檢測波長為254nm；進樣量為20μL。理論板數(shù)不低于3000[5]。

取系統(tǒng)適用性溶液、對照品與供試品溶液、適量陰性樣品溶液分別注入液相色譜儀中,于條件色譜下測定并記錄色譜圖。

2.2溶液制備 對照品溶液:精密稱取適量頭孢克肟對照品,加入磷酸緩沖液制成每毫升含0.2mg頭孢克肟的對照品溶液。

供試品溶液:取10袋供試品稱定,研細后稱取4.4mg放置于100ml容量瓶內(nèi),加入60ml磷酸緩沖液,超聲處理30min,放冷至室溫,再加入緩沖液稀釋至刻度,搖勻過濾。

系統(tǒng)適應(yīng)性溶液:精密稱取50mg供試品置于50ml容量瓶內(nèi),向其加入緩沖液進行溶解,再加水30ml沸水浴45min,放冷至室溫后,加入流動相稀釋至刻度,搖勻。

陰性樣品溶液:根據(jù)處方稱量輔料,按照供試品溶液方法配置陰性樣品溶液[6]。

降解溶液:①酸破壞:取50mg供試品放于50ml容量瓶,加5ml甲醇使其溶解,加入1mol/L鹽酸溶液5ml靜置1h,用同濃度的NaOH溶液與之中和,流動相稀釋至刻度,搖勻。②堿破壞:取50mg供試品置于50ml容量瓶內(nèi),5ml甲醇溶解,加0.1mol/L NaOH溶液3ml靜置10min,倒入同濃度HCl溶液中和,流動相稀釋至刻度,搖勻。③氧化破壞:取50mg供試品放置在50ml容量瓶內(nèi),5ml甲醇溶解,加5ml的3%過氧化氫溶液靜置1h,流動相稀釋至刻度,搖勻。④水解破壞:取50mg供試品于50ml容量瓶內(nèi),甲醇溶解,加30ml水,置于沸水浴內(nèi)45min,放冷后用流動相稀釋至刻度,搖勻。⑤加熱破壞:取50mg供試品,于105℃下加熱3h,放冷后倒入50ml容量瓶,甲醇溶解,用流動相稀釋至刻度,搖勻。⑥光照破壞:取50mg供試品,于254nm紫外光照射下進行24h照射,后置于50ml容量瓶內(nèi),甲醇溶解,用流動相稀釋至刻度,搖勻[7]。

2.3方法學(xué)考察 陰性干擾:按處方比例制備無頭孢克肟空白樣品,按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液,依次進樣。色譜圖見圖1。

圖1

線性關(guān)系考察:精密量取0.1182g頭孢克肟對照品放于100ml容量瓶內(nèi),緩沖液溶解稀釋至刻度,量取0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置于50ml容量瓶內(nèi),加緩沖液稀釋至刻度搖勻,吸取以上溶液20μL分別注入色譜儀中,根據(jù)色譜條件進樣,記錄色譜圖。以頭孢克肟進樣量作為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),計算其回歸方程。結(jié)果顯示,頭孢克肟進樣量在0.4～2.4μg與峰面積線性關(guān)系較好[8-9]。

精密度試驗:取對照品溶液在色譜條件下重復(fù)5次進樣,記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD=0.04%,說明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8h進樣。結(jié)果峰面積RSD=0.65%,提示供試品溶液在8h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一供試品,分別配置5份供試品溶液,進樣。結(jié)果含量RSD=0.45%,說明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗:取0.26g已知含量樣品,精密稱定。精密加入適量對照品,按供試品溶液方式制備溶液,用流動相稀釋至刻度,進樣記錄峰面積,測量含量并計算回收率[10-11]。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

2.4樣品含量測定 分別取10份樣品,按供試品溶液方式制備20μL溶液放置色譜儀內(nèi),記錄色譜圖,根據(jù)外標(biāo)法計算樣品中頭孢克肟含量,與2015版藥典中頭孢克肟含量測定方法測定結(jié)果比較[12]。結(jié)果批號為091001、091002、091003、091004、091005、091006、091007、091008、091009、091010樣品中含量分別為44.8、44.6、43.9、43.6、44.2、43.8、43.9、44.5、44.4mg/g。

3 討論

頭孢克肟為常用的頭孢類抗菌藥物,對大部分革蘭陰性、陽性均有較強抗菌性,能抑制多數(shù)菌種,臨床多用于泌尿系統(tǒng)、呼吸道感染等治療,不良反應(yīng)較少。《中國藥典》中關(guān)于頭孢克肟及制劑的含量測定采用四丁基氫氧化銨溶液作為其流動相[13]。由于頭孢克肟分子結(jié)構(gòu)中有弱酸性和弱堿性基團,故可調(diào)節(jié)溶液pH改變解離狀態(tài),進而調(diào)節(jié)在反向色譜上保留時間。本研究使用固定0.025mol/L磷酸鹽緩沖液濃度,10%乙腈,十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑,流動相pH改為3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2,考察系統(tǒng)適用性溶液內(nèi)不同pH流動相對頭孢克肟保留時間、分離度及前后相鄰峰、雜質(zhì)峰分離度影響[14]。結(jié)果表明pH增加,頭孢克肟分離度、理論塔板數(shù)減小,由于酸性可能過大,C18基團易斷裂,故本試驗采用磷酸鹽緩沖液pH3.6作為流動相,此時頭孢克肟有合適保留時間、理論板數(shù),其峰形較理想[15]。固定流動相pH3.6,改變乙腈為5%、10%、15%,結(jié)果顯示,乙腈為5%,頭孢克肟峰保留時間長；乙腈為15%時,頭孢克肟峰與其E異構(gòu)體峰難以分離；當(dāng)乙腈為10%,頭孢克肟峰及其異構(gòu)體峰保留時間較適中,分離度也較好,故本實驗選擇10%含量的乙腈。

綜上所述,本研究中色譜柱、流動相比例、流速、主峰峰形均良好,分離效果較佳；操作簡便,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,可用于頭孢克肟干混懸劑含量測定。