P53信號通路在苦參堿誘導人結腸癌SW-480細胞凋亡的作用機制

劉 斌 劉 曄

1.靖邊縣中醫醫院(陜西 榆林 718500);2.靖邊縣人民醫院(陜西 榆林 718500)

結腸癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一,據文獻報道結腸癌發病率在全球居第3位,且呈逐年增高趨勢[1]。P53起初被認為是致癌基因,隨著研究的深入,其抑癌功能陸續報道[2]。P53參與腫瘤的周期調控、細胞凋亡及抑制血管生成等過程[3]。中藥苦參堿(Matrine)除了具有抗心律失常、抗炎、抗病毒等作用外,還具有較強的抗腫瘤作用[4],但是苦參堿治療結腸癌相關研究報道較少,本研究通過使用苦參堿干預人結腸SW-480細胞,探究苦參堿對結腸癌細胞凋亡的影響及其分子機制,為后續深入研究提供理論基礎。

1 材料

一抗P53/E-Cad/Bax/β-actin購自proteintech公司,二抗購自中山金橋公司。蛋白提取試劑盒購自凱基生物公司,CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自北京全式金生物公司。Western Blot曝光儀購自AZURE公司,酶標儀購自bio-rad公司。

2 方法

2.1CCK-8實驗測定苦參堿對SW-480細胞的影響 將SW-480細胞接種于細胞培養皿內培養,等到細胞生長狀態良好時,消化細胞接后種于96孔板內,生長一段時間后加入含苦參堿細胞培養液,繼續在5%CO2細胞培養箱內培養,棄掉原培養液加入不含血清的細胞培養液,同時加入CCK-8檢測試劑,開始測定吸光度值并記錄實驗結果。

2.2Western blot檢測P53蛋白表達變化 將SW-480細胞接種于細胞培養皿內培養,等到細胞生長狀態良好時,加入含苦參堿的細胞培養,培養一段時間后收取細胞并提取蛋白。配置SDS-PAGE蛋白膠,加樣電泳結束后,開始轉膜,條件為300mA 轉模30～50min,待封閉完成后分別放入一抗(P53/E-Cad/Bax/β-actin)中室溫孵2～4h,洗膜后放入二抗(1∶4000)中室溫孵育1～2h,洗膜后加入發光液采集圖像,保存數據。

2.3統計分析 使用SPSS 19.0分析試驗數據,使用GraphPad Prism5.0作圖。原始數據符合正態分布,同時滿足方差齊性,則使用t檢驗或方差分析,P<0.05提示差異有統計學意義。

3 結果

3.1苦參堿對結腸癌細胞增殖力的影響 使用不同濃度含苦參堿培養基干預SW-480細胞,結果如圖1所示,當苦參堿濃度為3mg/mL時,能夠較好的抑制SW-480細胞的增殖。

圖1 苦參堿干預SW-480細胞活力測定

3.2Western blot 檢測P53蛋白表達水平 結果如圖2所示,使用2/3/4mg/mL的苦參堿干預細胞后,提取蛋白通過Western blot 檢測P53、Bax、E-Cad蛋白表達,結果MA組較CON組P53、Bax、E-Cad蛋白表達量明顯增高(P<0.05);MA2組較MA3組P53蛋白表達量明顯增高(P<0.05),MA4組較MA3組BAX/E-Cad蛋白表達量明顯降低(P<0.05)。

圖2 苦參堿干預SW-480 P53蛋白表達水平CON:對照組,MA:苦參堿干預組

4 討論

近年來隨著人們生活水平提高以及生活方式的改變,結腸癌的發病率及致死率逐年增高,嚴重危險到人類健康[5]。起初P53基因被認為是一種致癌基因,隨著研究的深入P53抑癌功能逐漸被揭示[6]。P53基因是人類腫瘤相關性最高的基因,P53基因廣泛分布于核仁、線粒體等結構中,參與細胞周期調控、細胞凋亡及維持基因組穩定等過程[7]。P53在不同組織中誘導細胞凋亡的機制不盡相同,P53通常在Bcl-2家族的作用下通過線粒體調控凋亡。Bcl-2家族主要由抑制細胞凋亡蛋白和促進細胞凋亡蛋白組成,Bax基因是人體最主要的凋亡基因,是極重要的促細胞凋亡(Apoptosis)基因之一[8]。研究發現 P53 作為轉錄因子在轉錄水平激活Bax的表達,進而引起細胞衰老,抑制腫瘤的增殖、促進腫瘤細胞凋亡[9]。單良[10]等研究報道明根皮素可通過激活ERK、P38通路增加P53、BAX蛋白表達水平,誘導人卵巢癌CAOV-3細胞凋亡,從而發揮抗癌作用。張蕾[11]等研究報道淫羊藿苷可顯著抑制小鼠CT26細胞結腸癌肝轉移瘤的生長,其機制可能與上調p53和Bax蛋白,下調Bcl-2蛋白有關。

苦參堿(Matrine)是臨床上一種常用中藥,研究表明苦參堿可抑制腫瘤細胞的增殖,臨床上苦參堿對白血病、肝癌和胃癌都有較好的療效,同時由于其毒副作用小,故有可能發展成為很好的抗腫瘤藥物[12]。張偉等[13]研究了不同濃度苦參堿對人急性淋巴細胞白血病侵襲轉移的抑制作用,結果發現苦參堿能全面抑制白血病細胞的粘附能力、運動能力和侵襲能力。E-Cad通過相連的鏈蛋白使相鄰的癌細胞相連,維持細胞間的粘附,當E-Cad表達降低,使其粘附性變小,發生侵襲和轉移[14]。楊鵬等研究發現苦參堿能夠誘導SW480細胞凋亡,該藥理作用可能與苦參堿對Akt信號通路的抑制有關[15]。李金州等研究表明苦參堿可抑制結腸癌SW480和SW480/M5細胞的增殖,克隆形成和遷移侵襲能力,其機制可能與抑制AKT/GSK3β/β-catenin信號通路有關[16]。

本研究使用中藥苦參堿干預人結腸細胞SW-480,通過CCK-8、Western blot技術檢測細胞增殖力及P53變化,以及腫瘤侵襲轉移因子E-Cad的變化情況,研究發現苦參堿能夠較好的抑制人結腸細胞SW-480的增殖力,使用苦參堿干預后,P53蛋白及其下游基因Bax表達量MA組較CON組升高,E-Cad表達量升高。

綜上所述,苦參堿可能通降低結腸癌細胞的侵襲和轉移能力,誘導結腸癌細胞凋亡,達到抗腫瘤作用。