TAA誘導(dǎo)的A型肝性腦病大鼠腸道通透性改變及機(jī)制研究

鄭 鋆

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院(福建 廈門 361006)

肝性腦病(Hepatic Encephalopathy,HE)是肝臟功能嚴(yán)重障礙和(或)門體分流所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)綜合征,是急性肝衰竭和慢性肝病終末期最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。按病因不同將此臨床綜合征分為三種類型,其中A型為急性肝衰竭相關(guān)的肝性腦病,預(yù)后最差[1]。目前,氨和腸道來源的毒素仍然是肝性腦病發(fā)病機(jī)制的核心[2],近年來研究顯示,在肝硬化和慢性肝病人群中腸道通透性存在異常增高[3],間接表現(xiàn)為外周血內(nèi)毒素水平和細(xì)菌DNA的增加；腸道屏障的破壞程度與肝功能Child分級(jí)呈正相關(guān),在合并腹水的失代償期肝硬化患者中腸道通透性增加更為明顯[4-5]。但關(guān)于肝性腦病狀態(tài)下腸道通透性改變的研究尚少,故設(shè)計(jì)了本次實(shí)驗(yàn),于2020年12月至2021年3月選取雄性SD大鼠30只隨機(jī)分至正常對(duì)照組和肝性腦病模型組,模型組造模成功后根據(jù)肝性腦病臨床分級(jí)將其進(jìn)一步細(xì)分為低級(jí)別肝性腦病組和高級(jí)別肝性腦病組；對(duì)比研究各組大鼠腸道通透性的差別并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行探討,為進(jìn)一步的臨床研究提供基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性SD大鼠30只:購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑 硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)及FITC-Dextran:購(gòu)自Sigma-Aldrich。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組造模 將雄性SD大鼠隨機(jī)分至正常對(duì)照組和肝性腦病模型組,正常對(duì)照組8只腹腔注射生理鹽水；肝性腦病模型組22只腹腔注射TAA(300mg/kg TAA連續(xù)3天每隔24小時(shí)腹腔注射),保證大鼠的行為自由和正常的日晝時(shí)間,然后每24h進(jìn)行監(jiān)測(cè)以挑選出其中確實(shí)患有肝性腦病的大鼠[6],對(duì)造模成功的大鼠根據(jù)肝性腦病臨床分級(jí)(表1)將其進(jìn)一步細(xì)分為低級(jí)別肝性腦病組(1～2級(jí))和高級(jí)別肝性腦病組(3～4級(jí))。

表1 SD大鼠肝性腦病臨床分級(jí)

1.3.2 離體腸道通透性測(cè)定 無菌條件下分離三組實(shí)驗(yàn)鼠的空腸,放置于含8.4mM HEPES,119mM NaCl,4.7mM KCl,1.2mM MgSO4,1.2mM KH2PO4,25mM NaHCO3,2.5mM CaCl2和11mM 葡萄糖的改良Krebs-Henseleit碳酸氫鹽緩沖液(KHBB緩沖液)中。被分離腸段的一端用縫線結(jié)扎,然后用管飼針將100μL 異硫氰熒光素-右旋糖苷(FITC-Dextran,分子量4000,熒光劑FD-4,40mg/mL)注入腸腔,注射過程中注意避免損傷腸粘膜。腸段的另一端也用縫線結(jié)扎,形成8cm長(zhǎng)的腸袋。用KHBB緩沖液漂洗后,將兩端結(jié)扎的腸袋置入2ml KHBB液中,37℃下孵育20分鐘。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定從腸腔滲入到孵育緩沖液中的FD-4。

1.3.3 腸壁水腫程度測(cè)定 采用干濕重法比較三組實(shí)驗(yàn)鼠腸壁水腫程度。取空腸一小塊,洗凈腸內(nèi)容物,普通濾紙吸干表面液體,稱重(濕重),記錄重量；然后放入50℃恒溫培養(yǎng)箱中烘干,3天后再稱重(干重),記錄重量。根據(jù)濕、干重比,了解腸壁水腫程度。

1.3.4 緊密連接蛋白及炎癥因子檢測(cè) RT-PCR法比較三組實(shí)驗(yàn)鼠空腸緊密連接蛋白ZO-1和Occludin及炎癥因子TNF-α的表達(dá)水平。TRIzol試劑提取組織內(nèi)總RNA,然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA；PCR條件如下:94℃ 5分鐘,之后95℃ 15秒,60℃ 30秒循環(huán)40次；內(nèi)參選用β-actin,相應(yīng)的引物序列如表2所示。

表2 引物序列

1.3.5 統(tǒng)計(jì)方法 三組數(shù)據(jù)間比較采用多因素方差分析(PCR數(shù)據(jù)采用2-△△Ct值作為原始數(shù)據(jù)參與計(jì)算),兩兩比較采用Bonferroni法,均為雙側(cè)檢驗(yàn),以P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0,作圖采用Graphpad Prism 6。

2 結(jié)果

肝性腦病模型組共獲得低級(jí)別肝性腦病大鼠和高級(jí)別肝性腦病大鼠各8只,死亡6只,正常對(duì)照組8只均存活；每日的肝性腦病臨床分級(jí)評(píng)估結(jié)果詳見表3。觀察造模結(jié)束后存活的各組動(dòng)物體重、腸道通透性及相關(guān)緊密連接蛋白/炎癥因子表達(dá)的變化情況如下。

表3 模型組動(dòng)物評(píng)估及分組情況

2.1體重變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:和對(duì)照組相比,肝性腦病組大鼠的體重有顯著下降(0.06±0.04 VS-0.07±-0.02 VS-0.17±0.03,P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；高級(jí)別肝性腦病組體重下降更為明顯,且與低級(jí)別肝性腦病組相比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖1)。

圖1 肝性腦病組與正常對(duì)照組大鼠體重變化情況

2.2腸道通透性變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:和對(duì)照組相比,肝性腦病組大鼠的單位面積離體腸道通透性(0.82±0.11 VS 1.36±0.30 VS 1.74±0.32,P<0.05)及腸壁水腫程度(3.02±0.18 VS 3.57±0.22 VS 4.44±0.43,P<0.05)均有顯著增加,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；高級(jí)別肝性腦病組腸道通透性增加更為明顯,且與低級(jí)別肝性腦病組相比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖2),說明肝性腦病這一病理狀態(tài)下確實(shí)存在腸道屏障的破壞,且破壞程度與肝性腦病分級(jí)存在相關(guān)。

圖2 肝性腦病組與正常對(duì)照組大鼠腸道通透性變化

2.3緊密連接蛋白及炎癥因子表達(dá)水平變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:和對(duì)照組相比,肝性腦病組大鼠的腸道緊密連接蛋白ZO-1(0.30±0.04 VS 0.27±0.05 VS 0.24±0.04,P=0.068)及Occludin(0.18±0.02 VS 0.18±0.03 VS 0.16±0.02,P=0.069)的表達(dá)下降,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,高級(jí)別肝性腦病組下降趨勢(shì)更為明顯,但與低級(jí)別肝性腦病組相比亦不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；炎癥因子TNF-α表達(dá)增加(0.03±0.01VS 0.04±0.01 VS 0.08±0.02,P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,高級(jí)別肝性腦病組增加更為顯著,且與低級(jí)別肝性腦病組相比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖3),說明炎癥反應(yīng)參與了腸漏的過程。

圖3 肝性腦病組與正常對(duì)照組大鼠緊密連接蛋白及炎癥因子表達(dá)水平變化

3 討論

肝性腦病根據(jù)病因不同可分為A、B、C三型。在急性肝衰竭引起的A型肝性腦病中,以肝功能嚴(yán)重障礙因素為主,而B型肝性腦病為單純門體旁路引起,無確切的肝細(xì)胞疾病,但臨床表現(xiàn)與C型相同；C型肝性腦病病因則為肝硬化伴門脈高壓和(或)門體分流。不同病因的HE發(fā)病機(jī)制均主要涉及三個(gè)環(huán)節(jié):第一,循環(huán)毒素如氨的產(chǎn)生,其中腸道是各類毒素進(jìn)入血液循環(huán)最主要的門戶；第二,肝功能損傷和(或)門體分流病理生理基礎(chǔ)存在:肝功能障礙導(dǎo)致肝臟的生物轉(zhuǎn)化能力下降,門體旁路導(dǎo)致腸道毒素未經(jīng)肝臟直接分流進(jìn)入體循環(huán)；第三,突破血-腦屏障的毒素對(duì)在不同水平上對(duì)腦功能的損害[2]。作為毒素來源的腸道是本研究關(guān)注的核心,因在健康個(gè)體中,腸道屏障完整,具有防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素等穿過腸粘膜進(jìn)入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能；而在肝損的病理狀態(tài)下,腸道屏障破壞可能導(dǎo)致毒素進(jìn)入血液循環(huán)增加,促進(jìn)HE的發(fā)生與發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)采用的是TAA致大鼠急性肝衰竭模型,該模型具有良好的重復(fù)性和可行性,是目前國(guó)內(nèi)外相對(duì)成熟和常用的動(dòng)物HE模型。在既往研究中觀察到在造模過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)不同程度的消化道癥狀如進(jìn)食減少、明顯的腹部膨隆、胃腸型等,腸壁組織病理學(xué)可見上皮細(xì)胞脫落及炎細(xì)胞浸潤(rùn)、絨毛壞死,符合腸道屏障功能障礙的表現(xiàn)[7]。這與本實(shí)驗(yàn)中觀察到的HE狀態(tài)下離體腸道通透性異常增高、腸壁水腫的結(jié)果相符合(P<0.05),且肝性腦病臨床分級(jí)越高、腸道通透性增加越顯著；以上都從不同角度說明腸道屏障破壞參與了HE的發(fā)病。

完整的腸道屏障包括物理屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障、細(xì)菌屏障等,其中物理屏障主要指上皮細(xì)胞自身的完整性及細(xì)胞間的緊密連接(Tight Junction,TJ)。緊密連接包含一系列跨膜蛋白家族,包括Occludin、Claudin等,其胞內(nèi)部分通過ZO蛋白與細(xì)胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)相連接以起到錨定作用,并受飲食、激素、炎癥因子等因素影響,通過磷酸化方式發(fā)生構(gòu)象改變,調(diào)節(jié)腸腔內(nèi)各類大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)[8,9]。研究認(rèn)為,在急慢性肝衰竭狀態(tài)時(shí)腸道局部及全身炎癥因子表達(dá)增加,而炎癥反應(yīng)可引起緊密連接蛋白表達(dá)水平的下調(diào),腸道屏障異常開放,導(dǎo)致菌群移位、內(nèi)毒素血癥等,進(jìn)一步加重肝損,同時(shí)腸道局部炎癥狀態(tài)又加劇了腸漏,形成惡性循環(huán)[10-13]。而TNF-α作為重要的促炎因子之一,已有研究提示針對(duì)腸道局部的TNF-α拮抗劑可抑制炎癥反應(yīng),減輕因腸道屏障破壞引起的機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)[14]。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到HE大鼠腸道組織局部TNF-α表達(dá)增高(0.03±0.01VS 0.04±0.01 VS 0.08±0.02,P<0.05),并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,緊密連接蛋白ZO-1及Occludin在基因表達(dá)水平方面存在下降趨勢(shì),與Luo等人的研究結(jié)果一致[15]；說明炎癥反應(yīng)引起的緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)與腸道屏障破壞和HE的發(fā)病相關(guān)。但研究在緊密連接蛋白基因表達(dá)水平方面未得到陽(yáng)性結(jié)果,可能與樣本量不足及檢測(cè)手段單一有關(guān),有文獻(xiàn)報(bào)道稱,LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷可導(dǎo)致ZO-1在蛋白表達(dá)水平上的下降(Western Blot法證實(shí)),同時(shí)免疫組化還發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞表面上的分布方式存在異常,表現(xiàn)為數(shù)量減少且更為碎片化[16]。

綜上,腸道通透性增加是肝性腦病發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)因素,而修復(fù)腸道屏障可能是未來具有吸引力的治療手段,鑒于它能夠避免針對(duì)其他一些致病機(jī)制進(jìn)行治療的不良反應(yīng)(如針對(duì)腸道菌群容易產(chǎn)生耐藥或菌群多樣性減少等),并且可以和其他現(xiàn)有治療手段相結(jié)合。對(duì)腸道屏障認(rèn)識(shí)的不斷深入,將使得未來開發(fā)修復(fù)腸道屏障的藥物成為可能,以造福于臨床HE患者。