抗弧菌光合細菌的分離鑒定及對氨氮和亞硝態氮的降解特性

王雨婷，周榮翔，李霽虹，張 瑤，周婷婷，陳文才，彭 云，湯曼利，馬桂珍，許建和

（1. 江蘇海洋大學環境與化學工程學院，江蘇 連云港 222000； 2. 江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222000； 3. 永清縣農業農村局種植業技術推廣站，河北 廊坊 065000；4. 江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇 連云港 222000）

弧菌病是常見的水產養殖病害[1]。近年來隨著水產養殖品種的增加和養殖規模的擴大，尤其是高密度養殖使水體自身調節能力降低，弧菌病害和氨氮 (NH4+-N) 過量對水產養殖的負面影響越來越嚴重，有關水產養殖過程中弧菌病防治和水體污染治理的研究備受關注[2]。目前主要采用化學、物理手段進行弧菌病的防治，但物理手段會造成水體二次污染，化學手段會導致病原菌的抗藥性，打破水域生態平衡，而生物手段則彌補了化學手段的不足，這類生態友好型的治理手段已成研發熱點[3]，生產上亟需更多的微生物制劑用于水產病害和水污染治理[4]。

光合細菌 (Photosynthetic bacteria, PSB) 是在厭氧條件下以光為能源，以二氧化碳 (CO2) 或有機物為碳源，進行不生氧光合作用的原核生物[5]。目前所知的光合細菌可分為著色桿菌科、外硫紅螺菌科、紫色非硫細菌、綠色硫細菌、多細胞絲狀綠細菌、螺旋桿菌科、含細菌葉綠素的專性好氧菌7大類群，其中在水產養殖方面應用最多的為紫色非硫細菌[6-8]。光合細菌將水體中的有機物轉化為自身生長所需的能量，與病原微生物形成競爭關系，從而成為優勢菌群，抑制病原菌的生長繁殖[9]，降低水產養殖病害的發生率，而且光合細菌所含的營養物質能夠提高養殖魚蝦的免疫力，大幅提升其產量[10]。光合細菌作為生防菌株，已有研究主要針對其能夠高效降解水體中的三態氮、硫化氫等有害物質[11]，而對同時具有弧菌拮抗作用和降解NH4+-N、亞硝態氮 (NO2?-N) 復合功能的光合細菌的研究較少。本研究通過分離篩選對弧菌具有抑制作用并能降解NH4+-N 和 NO2?-N 的優良光合細菌，以期為水產養殖病害的生物防治和養殖水污染治理提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試培養基 光合細菌富集培養基為氯化鈉 (NaCl) 2 g，七水硫酸鎂 (MgSO4·7H2O) 0.2 g，氯化銨 (NH4Cl) 1 g，磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 1.75 g，乙酸鈉 (CH3COONa) 3 g，酵母粉 1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，滅菌后加入 2 g 碳酸氫鈉(NaHCO3)。光合細菌分離培養基為光合細菌富集培養基添加1.7%瓊脂。光合細菌發酵培養基為LB培養基。弧菌的培養及抑菌作用測定培養基為2216E 培養基 (蛋白胨 5 g、酵母膏 1 g、磷酸高鐵0.01 g，瓊脂 20 g，陳海水 1 000 mL，pH 8.0)。NH4+-N 降解培養基為 NaCl 2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，硫酸銨[(NH4)2SO4] 0.2358 g，KH2PO41.75 g，CH3COONa 3 g，酵母粉 1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，滅菌后加入 2 g NaHCO3(NH4+-N 質量濃度為 50 mg·L?1)。NO2?-N降解培養基為 NaCl 2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaNO20.246 4 g，KH2PO41.75 g，CH3COONa 3 g，酵母粉 1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，滅菌后加入 2 g NaHCO3(NO2?-N 質量濃度為 50 mg·L?1)。檸檬酸鹽利用培養基為NaCl 2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NH4Cl 1 g，KH2PO41.75 g，檸檬酸鈉 3 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，滅菌后加入 2 g NaHCO3。

1.1.2 病原菌 副溶血弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、鰻弧菌 (V. anguillarum)、創傷弧菌 (V. vulnificus) 由本實驗室保藏提供。

1.2 樣品的采集與富集

從連云港海域海州灣、車牛山島、灌河入海口等區域采集海水樣品20個，海泥樣品4個，從南通市如東、啟東地區海域采集海水樣品4個，海泥樣品2個。

取5 mL樣品于25 mL富集培養基中，置于50 mL螺口離心管中，再加5 mL無菌液狀石蠟，30 ℃，2 000 lx 光照條件下富集培養，至培養物出現不同顏色。取1 mL培養物接種于新的富集培養基中繼續培養，重復3～4次，得到深色培養液。

1.3 海洋光合細菌的分離純化

采用雙層平板涂布法和雙層平板劃線法。取不同的樣品富集液，進行梯度稀釋，分別取不同樣品 10?4、10?5、10?6稀釋濃度的稀釋液 0.2 mL 涂布于光合細菌分離培養基平板上，用一層融化后冷卻至約45 ℃的分離培養基覆蓋，靜置凝固后，30 ℃光照條件下培養4 d。挑取紅色、紫色、棕色和綠色等不同顏色菌落至新的分離培養基的平板上進行三區劃線，進一步純化，至在顯微鏡下觀察菌體形態一致。

1.4 海洋光合細菌對弧菌的抑制作用測定

1.4.1 光合細菌菌懸液的制備 將分離得到的光合細菌菌株接種于裝有25 mL LB液體培養基的50 mL離心管內，加入5 mL滅菌石蠟，在30 ℃、光照強度 2 000 lx 下培養 4 d，菌液用無菌液體培養基調整光密度 (OD660 nm) 相等且 OD660 nm≥1.5。

1.4.2 對弧菌的抑菌作用測定 采用牛津杯法。將在2216E培養基斜面上培養24 h的供試3種弧菌用無菌生理鹽水洗下，制備成濃度為107個·mL?1的菌懸液，取0.1 mL菌懸液涂布在2216E培養基平板上。在距離培養皿邊緣1.5 cm處的含菌平板四周均勻放置牛津杯，每個牛津杯中注入200 μL光合細菌不同菌株濃度為107個·mL?1的菌懸液，以等量的無菌培養基為對照，28 ℃恒溫培養48 h，觀察測定抑菌圈直徑。每個菌株3個重復。

1.5 不同光合細菌菌株降解NH4+ -N和NO2? -N作用測定

1.5.1 標準工作曲線制作 分別采用靛酚藍分光光度法和鹽酸萘乙二胺分光光度法 (GB/T 11889—1989) 測定溶液中 NH4+-N 和 NO2?-N 質量濃度。分別以 NH4+-N 質量濃度和 NO2?-N 質量濃度為橫坐標，OD637 nm和 OD538 nm為縱坐標，制作標準曲線，建立回歸方程。

1.5.2 降解率測定 將光合細菌菌懸液 (OD660 nm≥1.5) 按10%的接種量接入裝有25 mL液體降解培養基的50 mL離心管中，加入5 mL滅菌石蠟，每個菌株3個平行，在30 ℃、光照強度2 000 lx下靜置培養 4 d。發酵液于 4 ℃、5 000 r·min?1條件下離心20 min，取上清液，測定不同菌株上清液的吸光值，根據標準曲線計算不同菌株發酵液中的氮質量濃度，以未接種的培養基作為對照，計算不同菌株的降解率。

式中：R為降解率；Ct為對照濃度；C0為處理濃度。

1.6 抑菌并高效降解NH4+ -N和NO2? -N光合細菌菌株的初步鑒定

1.6.1 形態學觀察 將篩選出的抑菌并高效降解NH4+-N 和 NO2?-N 的光合細菌菌株接種于光合細菌分離培養基上，在30 ℃、光照強度2 000 lx下靜置培養4 d，通過解剖鏡觀察培養基上菌落形態及顏色，挑取單菌落，進行革蘭氏染色和鞭毛染色，顯微鏡觀察菌體大小、形態和染色結果。

1.6.2 生理生化試驗 挑取菌株 3個單菌落至含2 mL無菌水的離心管中，振蕩均勻并制成0.5麥氏濁度的均一菌懸液，吸取50～100 μL菌懸液接種至不同的生化管中，按照說明書于不同條件下培養，觀察反應管的顯色結果，將顯色結果與《結果詮釋表》比對，確定反應結果，以大腸桿菌為對照菌。

檸檬酸鹽利用試驗：將光合細菌菌懸液(OD660 nm≥1.5) 按 10% 的接種量接入裝有 25 mL檸檬酸鹽利用培養基的50 mL離心管中，加入5 mL滅菌石蠟，在 30 ℃、2 000 lx 下靜置培養 4 d，觀察培養基顏色變化，確認菌株是否生長。

根據形態觀察和生理生化反應結果，對照《伯杰細菌鑒定手冊》《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行初步鑒定。

1.6.3 16S rDNA 序列分析 將 P-3菌株樣品送至上海生工生物工程有限公司，測定菌株的16S rDNA序列。所得的基因序列拼接完整后與NCBI數據庫中的已知序列進行BLAST比對，選取近源序列，采用MEGA 7.0軟件構建16S rDNA基因序列系統發育樹。

2 結果

2.1 海洋光合細菌的富集

在光照厭氧條件下30個不同樣品多次富集培養，有6個樣品出現了顏色變化，分離自灌河入海口海泥 (A) 為棕色，車牛山島海水 (B) 和南通如東海泥 (C) 均為深紅色，南通啟東海水 (D) 和連云港高公島表層海水 (E) 為紅色，海州灣海水 (F) 為綠色 (圖1)，其他樣品渾濁，未變色。

圖1 富集篩選培養后的培養液A. 灌河入海口海泥；B. 車牛山島海水；C. 南通如東海泥；D. 南通啟東海水；E. 連云港高公島表層海水；F. 海州灣海水。Figure 1 Culture medium after enrichment and screeningA. Sea mud of the river empties into the sea; B. Cheniushan Island sea water; C. Sea mud of Rudong, Nantong; D. Sea water of Qidong,Nantong; E. Surface water of Gaogong Island, Lianyungang;F. Sea water of Haizhou Bay.

2.2 海洋光合細菌的分離純化

將富集的30個樣品涂布于光合細菌平板上，從連云港高公島海域海水分離純化得到了橙紅色的P-1菌株，從南通如東海泥中分離得到紅色的P-2菌株，從連云港車牛山島海域海水分離得到深紅色P-3菌株。3個菌株的形態特征見表1、圖2和圖3，符合光合細菌的特征。

圖2 菌株P-1形態特征觀察a. 菌落特征；b. 菌株形態。Figure 2 Morphological characteristics of P-1 straina. Colony characteristics; b. Strain morphology.

圖3 菌株P-2形態特征觀察a. 菌落特征 (15×)；b. 菌株形態。Figure 3 Morphological characteristics of P-2 straina. Colony characteristics (15×); b. Strain morphology.

表1 分離得到的3個光合細菌菌株的形態特征Table 1 Morphological characteristics of three isolates of photosynthetic bacteria

2.3 光合細菌菌株對3種弧菌的抑制作用

菌株P-3對3種弧菌均有抑制作用，對鰻弧菌的抑菌圈較明顯，抑菌圈平均直徑為 (5.26±0.03)mm。菌株P-1、P-2在平板對峙試驗中，牛津杯周圍基本上未現抑菌圈，說明這2株菌對副溶血弧菌、鰻弧菌和創傷弧菌沒有拮抗作用 (表2、圖4)。

圖4 不同光合細菌菌液對副溶血弧菌 (a)、鰻弧菌 (b) 和創傷弧菌 (c) 的抑菌效果Figure 4 Antibacterial effect of against V. parahemolyticus (a), V. anguillarum (b) and V. vulnificus (c)

表2 不同光合細菌菌株對弧菌的抗菌效果Table 2 Antibacterial effect of strains against Vibrios

2.4 具有抑菌作用的光合細菌菌株降解NH4+ -N和NO2? -N 作用的測定

將光合細菌菌液加入含 50 mg·L?1NH4+-N、NO?2-N降解培養基中，光照厭氧條件30 ℃培養4 d，測定發酵液的吸光值，并通過回歸方程計算氮濃度，結果見表3。3株菌株降解氮的能力較強，其中菌株P-2的NH4+-N降解率最高 (93.39%)，菌株P-3的 NO2?-N 降解率最高 (94.98%)。

表3 3株海洋光合細菌對氨氮和亞硝態氮的降解率Table 3 Ammonia nitrogen and nitrite nitrogen degradation rate of three marine photosynthetic bacteria

2.5 抑菌并高效降解NH4+ -N和NO2? -N光合細菌菌株的鑒定

根據不同菌株抑菌作用、NH4+-N 和 NO?2-N 降解作用結果，菌株P-3對3種弧菌的抑制作用以及對 NO2?-N 的降解作用最強，同時對 NH4+-N 的降解率較高，作為高效抑菌降解 NH4+-N 和 NO2?-N 的優良菌株進行初步鑒定。

2.5.1 形態學觀察 菌落形態為紅色圓球狀，邊緣整齊，表面低突 (圖5)；該菌為革蘭氏陰性菌，細胞短桿狀，大小為 (1.34～1.62) × (0.33～0.59) μm，單根極生鞭毛 (圖6-a)；菌株P-3在光照厭氧條件下，培養液呈深紅色 (圖6-b)。

圖5 菌株P-3形態特征a. 菌落特征 (25×)；b. 菌株形態。Figure 5 Morphological characteristics of P-3 straina. Colony characteristics (25×); b. Strain morphology.

圖6 菌株P-3鞭毛染色 (a) 和液體培養物 (b)Figure 6 Flagella stained (a) and liquid culture (b) of P-3 strain

2.5.2 生理生化特性 菌株 P-3在麥芽糖、阿拉伯糖生化鑒定管顏色變為黃色、陽性，葡萄糖管顏色無變化，說明該菌具有分解阿拉伯糖和麥芽糖的能力，不能利用葡萄糖作為碳源；尿素酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶實驗呈陽性，表明菌株P-3能分解氨基酸使其脫羧生成胺；苯丙氨酸、肌醇試驗為陰性；檸檬酸鈉作為唯一碳源培養4 d，培養液顏色變為紅色，為陽性，表明菌株P-3可以利用檸檬酸鹽 (表 4)。

表4 菌株P-3生理生化試驗結果Table 4 Physiological and biochemical characteristics of P-3 strain

根據形態觀察結果和生理生化試驗，參照《伯杰細菌系統鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株P-3進行初步鑒定。

在厭氧光照條件下培養物為深紅色的光合細菌有紅假單胞菌屬、紅螺菌屬和紅微菌屬，紅螺菌屬菌體為螺旋狀，不具有脫氮能力，生境為淡水環境；紅微菌屬菌體為卵圓形至檸檬狀，依靠周生鞭毛運動，且不能利用檸檬酸鹽為碳源；紅假單胞菌屬的菌體為球形或桿狀，單根極生鞭毛運動，不能利用葡萄糖，可以利用檸檬酸鹽且具有脫氮作用，生境為海水環境，菌株P-3細胞形態、生理生化特性等與紅螺菌屬和紅微菌屬不同，而與紅假單胞菌屬的形態和生理生化特性一致，初步認為菌株P-3為紅假單胞菌 (Rhodopseudomonassp.，表 5)。

2.5.3 菌株 P-3 16S rDNA 序列分析 將菌株 P-3的16S rDNA基因序列與NCBI中的序列進行比對，選取同屬內同源相似性較高的不同菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，菌株P-3的16S rDNA與多株沼澤紅假單胞菌(R. palustris) 的相似性為99.31%，結果見圖7。

圖7 基于P-3菌株的16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Figure 7 Phylogenetie tree of P-3 strain based on 16S rDNA gene sequences

3 討論

有學者認為光合細菌具有類胡蘿卜素[12-13]、細菌葉綠素[14]等光合色素，在光照培養條件下，其培養液大多呈紅色、紫色或者綠色等[5]，如張小倩等[15]從遼河入海口篩選出1株產紅色色素能力較強的紅假單胞菌屬菌株，王蕊等[16]從凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei) 池塘水樣、底泥中分離到1株類胡蘿卜素含量較高的糞紅假單胞菌 (R.faecalis)。本研究分離到的3株光合細菌厭氧培養液顏色均為紅色，與已有的研究中菌液顏色相符，利用這一特性初步篩選菌株，有助于尋找到更多的光合菌株資源。

弧菌屬是水產養殖中一種常見的細菌性病原[17-18]，目前用于弧菌病的拮抗菌主要有乳酸菌[19]、芽孢桿菌[20]、光合細菌[21]等。張信娣等[22]研究發現球形紅假單胞菌X3在平板擴散法中對水產致病菌有微弱的抑制作用。本研究中的沼澤紅假單胞菌對副溶血弧菌、鰻弧菌和創傷弧菌均具有拮抗作用，與張信娣等[22]的研究結果相似。

光合細菌可以吸收水體中的NH4+-N、硝態氮(NO3?-N) 和 NO2?-N，起到改善水質、修復水環境的作用[23-25]。目前對改善養殖環境的光合細菌種類研究頗多，如海洋著色菌 (Marichromatium gracile)[26]、紅假單胞菌[27]、類球紅細菌 (Rhodobacter sphaeroides)[28]、沙氏外硫紅螺菌 (Ectothiorhodospira shaposhnikovii)[29]等，這些光合菌降解效率各不相同。本試驗分離篩選得到的菌株P-3與金春英等[30]和劉珍珠等[31]研究的沼澤紅假單胞菌降解效果相近。金春英等[30]分離出1株沼澤紅假單胞菌CQV97，其對不同質量濃度的 NH4+-N 和 NO2?-N 最大去除率分別為35%～96%和46.850%～99.998%；劉珍珠等[31]從冰川前緣原生裸地土壤中分離出1株為沼澤紅假單胞菌LG，菌株對NH+4-N的轉化率最高為65.71%，對NO3?-N的轉化率為95.58%，已有的研究表明光合細菌在養殖水體的NH4+-N和亞硝酸鹽降解中發揮了重要作用。

本試驗分離篩選得到的菌株P-3在NH4+-N和NO?2-N質量濃度為50 mg·L?1時，對NH+4-N和NO?2-N的降解率分別達89.68%和94.98%，同時對副溶血弧菌、鰻弧菌和創傷弧菌均具有抑制作用，具有復合功能，表現出潛在的開發應用前景。