茜素絡合物在青魚幼魚耳石上的標記效果評價

朱亞華，姜 濤，陳修報，劉洪波，楊 健,

（1. 南京農業大學無錫漁業學院，江蘇 無錫 214081； 2. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心/院長江中下游漁業生態環境評價與資源養護重點實驗室，江蘇 無錫 214081）

魚類標記在經濟魚類的洄游、擴散等生態學研究[1]，增殖放流成效評價[2]，漁業資源狀況評估[3-4]以及漁業管理措施的制定[5]等諸多方面具有重要的意義。與遺傳學標記方法[6]相比，基于魚體化學物質浸泡而使其耳石產生標記的方法具有成本低、易應用等優勢[6-9]。在魚類的全生活史過程中，作為主要起平衡和聽覺功能的鈣化組織，耳石的結構和組成均非常穩定，不受代謝影響[10]，故不僅被用于資源群識別[11]、生境履歷重建和破譯魚齡及生活史過程[12-13]，也常被用作對魚類進行特定化學標記的載體[7-9]。比如熒光化學物質會通過魚體結合于耳石中，相應結合區在特定激發光下發出熒光[9]，從而起到標記魚的效果；且標記時間較長，魚的死亡率較低[14-15]。茜素絡合物 (ALC) 就是其中廣受關注的一類[16-18]。

增殖放流一直是增殖漁業中的重要措施之一。開展增殖放流活動業已成為恢復野生魚類自然資源和促進漁民增收的重要手段[19-20]。為此，研發可支撐經濟魚類增殖放流效果評價的標記方法意義重大。青魚 (Mylopharyngodon piceus) 是我國著名的“四大家魚”之一，廣布于我國的長江流域、附屬支流及各地湖泊[16]，為淡水漁業資源主要增殖放流的經濟物種 (廣布種)。迄今，除王豐等[21]通過微衛星標記方法對人工飼養的青魚和野生青魚進行過初步鑒別外，尚未見其耳石標記方面的報道。本研究首次用茜素絡合物對青魚幼魚進行了浸泡標記，并對標記條件和效果進行了評價，以期為青魚探索一種合理有效的耳石化學標記方法，并為今后淡水魚類相關的增殖放流效果評估提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究在中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南泉基地開展。實驗中所需青魚幼魚 [全長 (44.09±6.89) mm，體質量 (0.59±0.32) g)] 于 2019年 6月 27日購自常州專業育苗場。實驗魚先放入裝有已提前曝氣 2 d 自來水的玻璃缸 (長 100 cm×寬 45 cm×高50 cm) 中暫養。在暫養過程中每日投喂粉狀普通配合飼料2次。每日清理殘餌、糞便并換水1次，換水量占養殖水體的1/3，同時在整個過程中保持水體持續充氣增氧。實驗水溫為28～32 ℃，自然光照，不控光周期。熒光染料茜素絡合物為上海生工生物工程股份有限公司生產，包裝規格為1 g·瓶?1，粉末狀。參考邱晨等[22]使用茜素絡合物對鯉 (Cyprinus carpio) 仔魚的浸泡濃度，實驗設置對照組 (0 mg·L?1) 和標記組 (100 mg·L?1)。浸泡標記實驗時對照組和實驗組青魚均置于實驗專用缸 (長30 cm×寬 20 cm×高 30 cm) 中。

1.2 實驗條件

本實驗分2個階段進行。第一階段為浸泡標記階段。2019年7月12日，從暫養缸中隨機挑選100尾魚 (已提前饑餓48 h)，將其分別放至含有0和 100 mg·L?1茜素絡合物實驗用水的上述標記專用缸中。實驗組和對照組各用1個缸，每個缸中均勻放入50尾。為了確保熒光物質能被清晰地標記上，浸泡時長設為48 h。在浸泡標記過程中魚體生長良好，未出現死亡或其他異常情況。第二階段為恢復續養階段。當浸泡完成后，將魚苗移至裝有曝氣水體的缸中，使其在里面自由游動3 min，然后換水重復操作3次。用此方法對魚體表面進行沖洗，去除染液，隨后移至恢復續養玻璃缸 (長100 cm×寬 45 cm×高 50 cm) 中養殖。在浸泡標記階段不喂食，當移至恢復續養玻璃缸后，開始正常投喂粉狀普通配合飼料，每日投喂2次，每日清理魚體排泄物并換水1次，在浸泡標記和恢復續養的整個階段中均正常充氣增氧，水溫保持在28～32 ℃，不控光周期。從移至恢復續養缸的當天計為第0天開始取樣，每次取樣5尾，每5 d取樣1次，取樣至第20天結束。

1.3 耳石的采樣及標記效果檢測

將樣本魚放至載玻片上，置于解剖鏡下，用剪刀將魚體頭部與身體分離，同時從頭部中間剪開，然后用解剖針從左右頭部聽囊取出3類耳石；先用去離子水清洗掉耳石上附帶的雜質及黏膜，再用無水乙醇進行脫水、干燥。使用體式顯微鏡對3類耳石形態進行拍照 (圖 1)。

圖1 青魚幼魚的3類耳石a. 矢耳石；b. 微耳石；c. 星耳石。Figure 1 Three types of otoliths from juvenile black carpa. Sagitta; b. Lapillus; c. Asteriscus.

參考邱晨等[22]對鯉仔魚熒光標記的處理措施，使用無色透明指甲油將耳石包埋固定在載玻片上 (無須打磨)，等指甲油完全凝固后，避光保存。通過日本OLYMPUS BX51型顯微鏡的可見光 (BS)、藍色激發光 (WBS)、綠色激發光 (WGS) 和紫色激發光 (WUS) 對其進行觀察[23]，比較最適光源，并利用顯微鏡自帶的Stream start軟件進行圖譜拍照和圖像處理。耳石標記效果參照歐陽斌和常劍波[24]的方法按無 (?)、微弱 (+)、較明顯 (++)、明顯 (+++)、非常明顯 (++++) 5個等級來記錄。為了方便對標記效果進行判別統計，本研究將上述5個等級的效果按 0 (無)、1 (微弱)、2 (較明顯)、3 (明顯)、4 (非常明顯) 來記錄。

1.4 耳石熒光標記環時間差的檢測

在進行耳石熒光標記的時滯觀察時，由于青魚已約2月齡，魚體較大，本研究將經無色透明指甲油包埋的耳石先用4 000目砂紙打磨，直至核心整個面完全暴露，進行拋光確保其表面無劃痕。后用二甲苯溶液對包埋耳石的無色透明指甲油進行溶解，在解剖鏡下用解剖針將耳石另外一面朝上，再在其表面用無色透明指甲油二次固定。對重新固定的耳石繼續用4 000目砂紙打磨，直至此面耳石核心也完全暴露，之后對其進行約10 s酸蝕，利用上述BX51型顯微鏡進行圖譜拍照得到日輪讀數，進而推算時滯。

1.5 數據處理

本研究中不同恢復養殖時間下標記組與對照組的全長、體質量數據采用 Excel 2016軟件進行處理分析并作圖，通過SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 經茜素絡合物浸泡后青魚生存與生長狀況

在浸泡標記和恢復續養過程中，標記組和對照組的攝食和游泳能力均表現正常。在浸泡標記期間，標記組和對照組均未出現死亡，成活率為100%。在恢復續養20 d過程中，標記組死亡2尾，對照組死亡0尾。因標記組魚的死亡發生于非采樣日，故死亡數對實驗魚的采樣和相應的測定無影響。對標記組和對照組所采魚樣本間的全長和體質量進行單因素方差分析，結果顯示在恢復養殖過程中除第10 天對照組與標記組全長存在顯著性差異(P<0.05) 外，其他各標記組和對照組全長與體質量差異均不顯著 (P>0.05， 圖 2)。

圖2 不同取樣天數標記組和對照組青魚幼魚的體質量和全長變化 (N=5)*. 兩組間差異顯著 (P<0.05)。Figure 2 Change of body mass and total length of black carp of marking group and control group on different sampling day (N=5)*. Significant difference between two groups (P<0.05).

2.2 3類耳石的熒光標記效果

通過調節可見光和不同種類的激發光，對本實驗中熒光標記的25尾魚共150個耳石 (微耳石、矢耳石、星耳石各50個) 進行觀察 (表1)。以浸泡標記后恢復續養第10天的青魚幼魚耳石為例 (圖3)，在矢耳石、微耳石和星耳石的邊緣均呈現不同顏色的標記環，且標記環信號強度不同。在可見光和綠色激發光下，耳石上的熒光標記環呈深紅色，但在可見光下觀察到的顏色偏暗，在綠色激發光下觀察到的偏亮，更易觀察；在藍色激發光和紫色激發光下，熒光標記環呈橘紅色；不同的是，在藍色激發光下，耳石未被標記的部分呈綠色，在紫色激發光下，則呈藍色?；謴屠m養20 d后 (表1)，在藍色激發光下觀測到總的標記強度>3，在綠色激發光和可見光下觀測到的標記強度<3，其中綠色激發光略優于可見光，在紫色激發光下觀測到的標記強度<2。對比在可見光和不同激發光下3種不同類型耳石的熒光標記環效果，顯示由于耳石的形狀、生長特性和取樣難易程度不同，其標記效果也存在差異。在4種不同的光源下，微耳石上可觀測到的熒光信號強度>3，矢耳石上可觀測到的熒光信號強度>2，而星耳石的熒光信號強度則<2；但在可見光下，星耳石的熒光檢測效果強度則要優于另兩種耳石，最接近3。因此，對于青魚耳石熒光標記效果的檢測光源，藍色激發光最適宜，其后依次為綠色激發光、可見光和紫色激發光。在最適激發光即藍色激發光下，微耳石為最佳檢測耳石類型，但在可見光下用于標記最佳檢測的類型則是星耳石。

2.3 不同恢復續養天數下3類耳石在可見光和不同激發光下的熒光信號強度

隨著恢復續養天數的增加，經過茜素絡合物浸泡的青魚幼魚不同耳石熒光標記環強度在可見光和不同激發光下有不同變化 (表1)。從浸泡標記結束當日，即第0天開始取樣時經過48 h浸泡的青魚幼魚矢耳石、微耳石、星耳石均已能檢測到標記環，尤其是在微耳石上觀察到的熒光信號更為強烈。當把浸泡標記過的魚移到正常水體恢復續養后，在此過程中耳石的日輪繼續正常生長，熒光信號標記輪完全形成，此時熒光標記環不止與浸泡標記前的日輪顏色形成對比，還和浸泡標記后新形成的日輪顏色形成對比，熒光信號強度極易辨認及區分。隨著恢復續養天數的增加，矢耳石和星耳石的熒光標記環強度均有略微下降的趨勢，但在藍色激發光和綠色激發光下直到第20天時依然能夠在上面觀察到明顯的橘紅色和深紅色的標記環。微耳石則不管是在可見光還是在不同激發光下均保持較好的標記效果，特別是在藍色激發光下，從開始形成熒光標記環到第20天取樣結束的過程中，熒光標記環的強度逐步增加并保持不變 (圖4)?？傮w上在最佳檢測光源即藍色激發光下，微耳石上的熒光標記信號在20 d的恢復過程中表現出較好的標記效果，且能穩定保持。

圖4 青魚幼魚經茜素絡合物浸泡標記后恢復續養第0、第5、第10、第15和第20天時微耳石在藍色激發光的標記效果Figure 4 Marking effect of lapillus of juvenile black carp under blue light source on 0th, 5th, 10th, 15th,20th day of recovery culture after ALC immersion

表1 青魚幼魚3類耳石在不同光源下的檢測效果Table 1 Detection effect of three types of otoliths from juvenile black carp under four different light sources

2.4 茜素絡合物在青魚幼魚耳石上沉積的時間差

以浸泡標記后恢復續養第5天的青魚幼魚微耳石為例 (圖5)，經打磨、酸蝕后耳石日輪顏色加深，能明顯觀察到紫紅色的熒光標記環。由于魚體日齡較大，因此以觀察到的耳石熒光標記環外部日輪數倒推茜素絡合物在青魚耳石上沉積的時間差。魚體在第一日輪形成之后，1日齡即對應1日輪，因此在恢復續養第5天進行取樣時，魚體應比浸泡標記完成當日多生長出5日輪，但在實際的日輪觀察中，于自然光下可以看到共有2個紫紅色標記環的日輪，在紫紅色的標記環外，耳石新生長出4個日輪且無標記顏色，即魚體在在浸泡標記的第2天茜素絡合物開始在魚體的耳石上沉積，進入恢復續養的第1天熒光標記染料仍在其上沉積，因此將魚體放入茜素絡合物溶液中與其在耳石上的沉積及將魚體移出茜素絡合物溶液與其在耳石上標記顏色的消失均存在約 1日輪 (即 1 d) 的時滯。

圖5 青魚幼魚經茜素絡合物浸泡標記后恢復續養第5天時微耳石標記效果2個白色箭頭分別指向微耳石的2條紫紅色標記環；黑色短線表示微耳石新形成的日輪所在位置，即為一明帶和一暗帶組合；4個黑色箭頭則分別指向微耳石外部新形成的4個日輪。Figure 5 Marking effect of lapillus of juvenile black carp under four light sources on 5th day of recovery culture after ALC immersionTwo white arrows point to two purple red marker rings in lapillus; the black dash shows the position of the newly formed daily growth increments in lapillus, which is a combination of a bright band and a dark band; the four black arrows point outward to the four newly formed daily growth increments in lapillus.

3 討論

3.1 3類耳石熒光標記的差異性

本研究中用可見光和3種不同激發光對耳石進行觀察，發現3類耳石的熒光標記效果差異主要取決于青魚耳石自身的特性及在取樣過程中的難易程度。由于普通光源對3類耳石的穿透能力不同[17]，而激發光具有超強的穿透力，星耳石被標記的部分熒光標記環依稀可見，但因其較薄，在可見光下可看到一個深紅色的標記環；矢耳石的形狀為箭矢型，在生長過程中其核心周圍部分變厚、兩端向前延伸變薄，耳石兩端尖細的部分在前處理過程中易受外力破壞，造成標記環丟失，因此熒光標記環僅能在局部觀察到，標記效果較差 (圖3-a1)；對于微耳石，整個耳石為橢圓形，不僅有一個規則的外形，且具有一個明顯且規則的核心，耳石較厚，在取樣過程中不易受外力影響，耳石日輪較有規律地圍繞核心排列生長，在不同激發光下均能在耳石邊緣觀察到一個完整的熒光標記環，因此微耳石的熒光檢測效果最佳。但由于耳石較厚，在可見光下的標記環較難觀察到，考慮到對日輪進行觀察時需要計數，要求輪紋的排列整齊有序，此時矢耳石和星耳石就變得不可選擇，可對微耳石打磨后觀察標記效果。因此，進行標記效果檢測且需同時觀察日輪時，可優先考慮用微耳石。而邱晨等[25]觀察鯽(Carassius auratus) 幼魚的熒光標記發現，在激發光下對星耳石熒光標記觀測效果優于微耳石和星耳石，而在可見光下微耳石的標記效果則優于另兩種，這可能是由于不同種類的魚體耳石存在形成差異所致。

圖3 經茜素絡合物標記后恢復續養第10天時青魚幼魚矢耳石、微耳石、星耳石分別在可見光、藍色激發光、綠色激發光和紫色激發光下的標記效果a1. 矢耳石分別在可見光、藍色激發光、綠色激發光和紫色激發光下的標記效果；b1. 微耳石分別在可見光、藍色激發光、綠色激發光和紫色激發光下的標記效果；c1. 星耳石分別在可見光、藍色激發光、綠色激發光和紫色激發光下的標記效果；圖中白色箭頭表示由矢耳石、微耳石、星耳石核心指向熒光標記輪。Figure 3 Marking effect of three types of otoliths of juvenile black carp under different light sources on 10th day of recovery culture after ALC immersiona1. Marking effect of sagitta under visible light, blue excitation light, green excitation light and purple excitation light; b1. Marking effect of lapillus under visible light, blue excitation light, green excitation light and purple excitation light; c1. Marking effect of asteriscus under visible light,blue excitation light, green excitation light and purple excitation light. The white arrows show that the core of sagitta,lapillus and asteriscus point to the fluorescent marker ring.

3.2 影響青魚耳石熒光標記效果的因素

熒光標記效果受到浸泡標記濃度和時間的制約。一般標記濃度越高，浸泡時間越長，熒光標記產生的效果越好[24]。但在實踐中應考慮經濟成本且高濃度溶液長時間浸泡可能會對魚體的生理活動產生一定影響，因此需選擇適當的浸泡濃度和浸泡時間。趙亞鵬等[26]用不同濃度的茜素絡合物溶液標記滇池金線鲃 (Sinocyclocheilus grahami)，結果顯示溶液質量濃度達到150 mg·L?1時仔魚已經開始死亡，大于 200 mg·L?1時 90日齡稚魚全部死亡。劉清等[27]在進行鳙 (Aristichthys nobilis) 耳石茜素絡合物標記時也發現，相較于24 h的標記時間，48 h的鮮艷程度和標記效果更好，因此對于仔幼魚來說質量濃度應盡量小于 150 mg·L?1，且以48 h的浸泡時長較適宜。此外，在相同的浸泡時間下，隨著茜素絡合物濃度增加，耳石上標記信號強度增大，實驗魚死亡率也升高；同時在相同的浸泡濃度下，隨著時間的增加，耳石上標記信號強度增大，實驗魚死亡率也升高[18]。值得注意的是，相較于淡水魚類，海洋魚類可能會有所不同，Becker等[7]對日本白姑魚 (Argyrosomus japonicus) 用不同的浸泡時間 (6、12和 24 h) 和不同浸泡質量濃度(0、100、150和 200 mg·L?1) 結合來標記，在最長浸泡時間 (24 h) 與最大質量濃度 (200 mg·L?1) 組合下標記效果最好，且未出現死亡。因此，在浸泡標記魚體過程中，對于不同魚類，要想在不影響魚體正常生命活動的前提下達到理想的標記效果，對浸泡濃度和浸泡時間的研究則非常必要。

熒光標記效果除了與標記條件 (如濃度、時間等) 密切相關外，還與標記魚的生活史及發育階段關系密切。Unfer和Pinter[9]用茜素紅標記褐鱒(Salmo trutta) 的胚胎耳石，不僅死亡率低、標記成功率高，而且也降低了成本。靳建波等[28]對秦嶺細鱗鮭 (Brachymystax lenok tsinlingensis) 的發眼卵和仔稚魚進行茜素絡合物標記，也發現發眼卵需要的標記濃度更低，但標記效果卻更好?？紤]到不同規格的魚種對茜素絡合物耐受限度不同，王正鯤等[17]用不同規格唐魚 (Tanichthys albonubes) 進行茜素絡合物浸泡，發現最適濃度不盡相同，其仔稚魚、幼魚和成魚的最適質量濃度分別為80、100和 150 mg·L?1。徐永江等[18]用茜素絡合物對半滑舌鰨 (Cynoglossus semilaevis) 進行標記，發現 70 d魚苗的標記效果要優于170 d的魚苗。Cottingham等[16]用茜素絡合物對布氏棘鯛 (Acanthopagrus butcheri) 幼魚進行標記，其耳石上的標記效果能保持16年之久。因此熒光標記一般對早期生活史階段的個體效果更好。本實驗中，由于魚體已達幼魚階段，直接以較為保守的 100 mg·L?1進行 48 h 浸泡探索，在魚體的3類耳石上均能夠檢測到標記，獲得了不錯的標記效果。

3.3 茜素絡合物在青魚幼魚耳石上沉積時間差的影響因素

激發光的光源具有衍射性，故對魚體耳石進行日輪觀察時應在可見光下進行。經茜素絡合物浸泡標記后的耳石日輪在可見光下呈紫紅色，但隨著魚體的生長，耳石日輪逐漸密集，即使在可見光下對日輪數目的觀察也需經過一些特殊處理，以便于對耳石日輪數目進行計算。迄今，就魚體標記的時滯問題報道較少，朱亞華等[29]研究了經茜素絡合物浸泡的草魚 (Ctenopharyngoclon idellus) 耳石時滯，發現魚體開始浸泡和轉移出標記溶液與標記環的出現和消失存在約12 h時滯；邱晨等[22]對經茜素絡合物標記的鯉仔魚標記環進行觀察，發現耳石上熒光信號出現和消失的時間與魚體浸泡開始和結束的時間存在1 d時滯，但用鍶 (Sr) 溶液對鯉仔魚進行標記時發現，在浸泡后第3天耳石上才開始出現Sr標記，在浸泡結束后第6天Sr標記區才完全消失[30]；本實驗的結果與之相似。由此可見，元素在魚體耳石上沉積的時間差不僅與被標記的種類有關，更與標記的物質相關。這可能與魚類對不同化學物質的代謝速率有關[31]。

4 結論

本研究表明，使用茜素絡合物對青魚幼魚進行浸泡，其3類耳石在可見光和不同激發光下均可見明顯的標記環，標記率達100%。最佳觀察光源為藍色激發光，其次是綠色激發光。標記觀察的最適耳石類型為微耳石。在長達20 d的恢復續養過程中，熒光標記環信號強度保持穩定。從用茜素絡合物溶液開始浸泡魚體至其在耳石上產生沉積和將魚移出溶液至標記在耳石上消失均存在約1 d的時滯。用茜素絡合物化學標記青魚幼魚的方法有效且適用，這對于區分人工放流和野生種群，把握增殖放流青魚對自然資源量恢復的貢獻作用等研究有一定的參考價值。