非小細(xì)胞肺癌組織中T細(xì)胞免疫球蛋白區(qū)黏蛋白-3、程序性死亡因子-1及程序性因子配體1的表達(dá)分析

梁樂(lè)樂(lè),王 鵬 ，劉俊霞， 董 玉，郭 華

(1．陜西省人民醫(yī)院急診科,陜西 西安 710068；2．西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院,陜西 西安 710109； 3．西安市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,陜西 西安 710004)

肺癌為現(xiàn)階段發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤疾病，此種疾病發(fā)病因素較為復(fù)雜，非小細(xì)胞肺癌則為肺癌內(nèi)發(fā)病率最高的腫瘤疾病，可占肺癌總數(shù)約80%左右。多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者被確診后已經(jīng)處于中晚期，且由于免疫系統(tǒng)失調(diào)，癌細(xì)胞可快速增殖并可轉(zhuǎn)移至其他位置，使得患者預(yù)后效果較差，生存率較低。有研究認(rèn)為，免疫系統(tǒng)在腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖過(guò)程中有重要作用[1-2]。在不同腫瘤免疫應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)，T細(xì)胞免疫球蛋白區(qū)黏蛋白-3(T cell immunoglobulin domain mucin-3，TIM-3)可表達(dá)于多種細(xì)胞內(nèi)，主要為：巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)以及單核細(xì)胞等，可有效調(diào)節(jié)機(jī)體自然免疫、特意性免疫，充分發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)。程序性死亡因子-1(Programmed death factor-1，PD-1)和程序性因子配體1(Programmed factor ligand 1，PD-L1)則為負(fù)性T細(xì)胞刺激分子，可產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制免疫應(yīng)答，并可介導(dǎo)免疫逃逸[3-4]。免疫治療屬于現(xiàn)階段疾病治療熱點(diǎn)，本次研究主要分析PD-1、PD-L1、TIM-3于非小細(xì)胞肺癌組織、正常組織內(nèi)表達(dá)狀況，進(jìn)而判定各種指標(biāo)和患者疾病之間關(guān)系，進(jìn)而為疾病治療提供新方向。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2019年12月我院收治的67例非小細(xì)胞肺癌患者及健康患者60例。非小細(xì)胞肺癌患者中男34例，女33例，年齡55～70歲，平均(63.41±3.87)歲，高分化16例，中分化23例，低分化28例，TNMⅠ期13例，TNMⅡ期29例，TNMⅢ期25例，32例患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。健康患者中男30例，女30例，年齡56～68歲，平均(62.94±4.03)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者首次確診為非小細(xì)胞肺癌;②近期接受手術(shù)切除、放療、化療患者;③患者均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者;②合并肝腎功能異常患者;③合并嚴(yán)重惡化。兩組研究對(duì)象的一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 腫瘤細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜有棕黃色顆粒時(shí)可判定為陽(yáng)性。使用5個(gè)高倍視野×400,依據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分(0分為五色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色)；陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分時(shí)：0分表示陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞0～10%；2分為陽(yáng)性細(xì)胞11%～50%；3分為陽(yáng)性細(xì)胞51%～75%；4分為陽(yáng)性細(xì)胞76%～100%。染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞率為3分之上可判定為陽(yáng)性。PD-1 陽(yáng)性：低倍鏡觀察切片，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡，觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，平均值為PD-1陽(yáng)性計(jì)數(shù)。所有患者出院之后均通過(guò)電話方式進(jìn)行隨訪，主要隨訪內(nèi)容為門診復(fù)查以及住院信息，生存期，腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等狀況。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比非小細(xì)胞肺癌患者臨床指標(biāo)變化。其中主要以不同檢測(cè)方式陽(yáng)性率為判定標(biāo)準(zhǔn)，判定TIM-3、PD-1、PD-L1陽(yáng)性率。

2 結(jié) 果

2.1 非小細(xì)胞肺癌患者TIM-3、PD-1、 PD-L1陽(yáng)性率比較 非小細(xì)胞肺癌組TIM-3、PD-1、PD-L1診斷時(shí)陽(yáng)性率高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者TIM-3、PD-1、PD-L1陽(yáng)性率比較[例(%)]

2.2 非小細(xì)胞肺癌患者臨床指標(biāo)和病理特征關(guān)系 男性、女性，不同年齡患者TIM-3、PD-1等指標(biāo)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；無(wú)淋巴結(jié)、無(wú)轉(zhuǎn)移、中高級(jí)患者、Ⅱ期患者PD-1、TIM-3等指標(biāo)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 非小細(xì)胞肺癌患者臨床指標(biāo)和病理特征關(guān)系[例(%)]

2.3 非小細(xì)胞肺癌患者TIM-3、PD-1、 PD-L1的Logistic回歸分析 以研究TIM-3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TIM-3分化、TIM-3TNM分期、PD-L1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1分化、PD-L1TNM分期為自變量，以研究對(duì)象是否發(fā)生非小細(xì)胞肺癌疾病為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3，TIM-3、PD-L1指標(biāo)為獨(dú)立判定患者肺小細(xì)胞癌指標(biāo)。

表3 非小細(xì)胞肺癌患者TIM-3、PD-1、PD-L1的Logistic回歸分析

3 討 論

肺癌為常見(jiàn)疾病，近年有發(fā)病率和病死率逐步提升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們身體健康。多數(shù)患者診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期，傳統(tǒng)治療方式為化療和放療，雖然可控制疾病但改善效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足人們真實(shí)需求，深入研究疾病和疾病內(nèi)各指標(biāo)的變化便十分重要[5-6]。腫瘤細(xì)胞在增殖和浸潤(rùn)、擴(kuò)散過(guò)程中，巨噬細(xì)胞和炎癥因子對(duì)于促使腫瘤血管生長(zhǎng)有重要作用。巨噬細(xì)胞活化不僅可加速新陳代謝，同時(shí)也可通過(guò)免疫介導(dǎo)信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。T細(xì)胞為重要腫瘤免疫應(yīng)答細(xì)胞，T細(xì)胞激活之后可有效控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，也可調(diào)控T細(xì)胞激活所需協(xié)同信號(hào)刺激，在各種免疫檢查方法中主要分子為：TIM-3、PD-1、PD-L1三個(gè)指標(biāo)均在腫瘤發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。

TIM-3也可稱之為HAVCR-2，此為TIM龐大家族重要成員，主要作用為調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能。其中TIM-3基因結(jié)構(gòu)和家族其他編碼蛋白基因一樣，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其中主要包括多個(gè)結(jié)構(gòu)域、橫跨細(xì)胞膜。現(xiàn)階段多數(shù)研究認(rèn)為TIM-3可在多類型腫瘤細(xì)胞表達(dá)，且在生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可起到重要作用，且嚴(yán)重影響預(yù)后效果[7-9]。有學(xué)者提出，干擾腦膠質(zhì)瘤內(nèi)TIM-3表達(dá)之后藥物殺傷作用可顯著提升，該研究結(jié)果表示TIM-3參與惡性腫瘤耐藥[10]。也有對(duì)于肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞上常會(huì)出現(xiàn)TIM-3表達(dá)，且PD-1僅于TIL上進(jìn)行表達(dá)，無(wú)論為腫瘤細(xì)胞還是TIM-3陽(yáng)性，均和患者高細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD8表面蛋白相關(guān)[11]。TIM-3主要出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，且和患者疾病惡化程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。TIM-3高表達(dá)可引發(fā)免疫抑制、腫瘤免疫逃逸，當(dāng)TIM-3和陪體Gal-9結(jié)合之后會(huì)誘導(dǎo)CTL、Th1細(xì)胞凋亡進(jìn)而表現(xiàn)出免疫耐受。TIM-3也可通過(guò)控制T細(xì)胞擴(kuò)增有效抑制樹(shù)突狀細(xì)胞活化進(jìn)而出現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。本次研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，TIM-3檢測(cè)時(shí)非小細(xì)胞肺癌陽(yáng)性率可達(dá)52.23%之上，且隨著患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病持續(xù)惡化、分化加劇可使得患者陽(yáng)性率逐步提升。因此可知TIM-3在疾病發(fā)展和惡化過(guò)程中有重要作用，同時(shí)也影響患者生存的重要因素。也有研究提出隨著TIM-3陽(yáng)性率提升疾病惡化程度逐步提升，其中淋巴轉(zhuǎn)移以及分期晚的陽(yáng)性率顯著高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移患者。該研究結(jié)果也表示，隨著TIM-3高表達(dá)和患者惡性程度較高，更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

PD-1、PD-L1則為負(fù)性共刺激分子免疫球蛋白超家族成員，PD-1主要出現(xiàn)在各種細(xì)胞內(nèi)，主要為B細(xì)胞、T細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞，其中PD-L1主要出現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞和B細(xì)胞內(nèi)，食管癌和非小細(xì)胞肺癌患者也會(huì)出現(xiàn)[12]。PD-1也可稱之為CD279，也為268-氨基酸蛋白質(zhì)，主要出現(xiàn)于T細(xì)胞，也有少量表達(dá)在活化NKT細(xì)胞等免疫細(xì)胞，PD-L1也可和PD-L2特異性結(jié)合。其中PD-1和配體結(jié)合時(shí)可有效控制T淋巴細(xì)胞活化，也可引發(fā)腫瘤免疫逃逸。在多數(shù)研究中認(rèn)為PD-1可在惡性腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)異常，且可直接影響患者生活質(zhì)量[13-14]。也有研究提出PD-1可直接參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，并和患者總生存率有關(guān)，隨著PD-1水平提升患者生存率也逐步降低[15]。也有研究認(rèn)為隨著PD-1陽(yáng)性率提升，腫瘤分化程度更為嚴(yán)重，且更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分期相對(duì)更晚，患者生存率也會(huì)受到影響[16]。

腫瘤微環(huán)境內(nèi)，PD-L1/PD-1信號(hào)主要負(fù)責(zé)調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)而形成負(fù)性腫瘤環(huán)境，不僅會(huì)引發(fā)腫瘤免疫逃逸，同時(shí)在疾病發(fā)展過(guò)程中也有重要作用。分析本次研究過(guò)程數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，PD-L1診斷時(shí)患者陽(yáng)性率為61.19%，同時(shí)非小細(xì)胞肺癌患者陽(yáng)性率和腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)關(guān)系，隨著疾病惡化逐步加劇陽(yáng)性率呈逐步提升趨勢(shì)[17-18]。當(dāng)PD-1和PD-L1結(jié)合之后，可使得PD-1胞質(zhì)區(qū)免疫受體酪氨酸抑制基序結(jié)合內(nèi)酪氨酸磷酸化，也會(huì)使得SHP-2磷酸酶逐步提升，進(jìn)而使得SHP-2磷酸酶可持續(xù)提升，引發(fā)Syk以及磷脂酞肌醇3各種下游分子去磷酸化，抑制喜好傳導(dǎo)。淋巴細(xì)胞增殖活化以及輔助細(xì)胞T分化也會(huì)受到抑制，進(jìn)而使得患者機(jī)體呈現(xiàn)免疫負(fù)調(diào)節(jié)。其中PD-1/PD-L1刺激分子也可使得免疫應(yīng)答產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)，最終使得腫瘤免疫出現(xiàn)逃逸。也有學(xué)者提出，對(duì)于無(wú)禁忌證非小細(xì)胞肺癌患者，采用免疫檢查和抑制劑治療后，總有效率良好，此種治療方式主要原理即為控制PD-1/PD-L1，使得患者產(chǎn)生抗性，其中TIM-3也可作為免疫抑制劑進(jìn)行治療[19-21]。因此可知TIM-3等指標(biāo)不僅可用于診斷患者疾病，同時(shí)也可用于監(jiān)測(cè)患者疾病惡化。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌患者中TIM-3、PD-1、PD-L1的陽(yáng)性率均較高，其中TIM-3、PD-L1可作為監(jiān)測(cè)非小細(xì)胞肺癌的分子標(biāo)志物，且各分子也有望成為疾病治療新方向。