血管生成素-2促進內皮細胞基質金屬蛋白酶-2表達實驗研究

吳皓宇，曹懌瑋，汪玲果，常鳳軍，刁佳宇

(陜西省人民醫院，陜西 西安 710068)

隨著我國社會老齡化和城市化進程速度加快，人們生活水平提高后居民不健康生活方式的普及，心血管危險因素普遍暴露，冠心病的發病率和病死率具有逐年升高并呈現出年輕化的態勢，已經進展為威脅人類健康的重要疾病。動脈粥樣硬化斑塊的形成是冠心病發病的重要病理基礎，深入研究動脈粥樣硬化斑塊形成的機制，早期干預動脈粥樣硬化斑塊的發生及穩定性，建立有效防治動脈粥樣硬化的策略變得極為迫切。

基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是基質金屬蛋白酶家族中重要的一員，主要來源于內皮細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞等，是一種酶活性鋅離子依賴性肽鏈內切酶家族[1]。MMP-2具有多種生物學效應，生理狀態下參與機體的正常發育，當機體受到不利刺激或在病理條件下時MMP-2表達增加和活性增強，其主要功能是降解細胞外基質，影響細胞與細胞和基質之間的信號傳遞，對細胞的生長分化、遷移、黏附、損傷及修復等方面產生影響，在促進動脈粥樣硬化斑塊形成、降低斑塊穩定性和促進惡性腫瘤轉移等方面起重要作用[2]。血管生成素-2(Angiopoietin，Ang-2)是血管生成素家族的一員，通過與血管內皮生長因子結合，促進新生血管生成。Ang-2本身能增加血管的通透性，增強單核細胞的生存能力，促進單核細胞遷移，同時增強腫瘤壞死因子-α誘導的單核細胞粘附等。因此Ang-2被認為是炎性因子，在動脈粥樣硬化形成過程中發揮作用，在急性冠脈綜合征患者中表達明顯增加[3]。Ang-2還在許多惡性腫瘤組織中表達增加，參與腫瘤組織的轉移，通過腫瘤病理組織分析發現，Ang-2可能通過整合素αvβ1促進MMP-2表達進而促進腫瘤轉移[4]，但在動脈粥樣硬化中缺乏相關研究。Ang-2和MMP-2在動脈粥樣硬化斑塊進展及穩定性中的相互作用和關系目前僅局限于臨床觀察，缺乏具體機制的探討，尚無體外實驗依據。本研究通過細胞實驗探討Ang-2與MMP-2的關系及可能的作用機制，為進一步探討兩者在動脈粥樣硬化中的作用和關系提供實驗支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人臍靜脈血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自武漢益普生物科技有限公司。Ang-2腺病毒和αvβ1 siRNA腺病毒購自賽業生物科技有限公司。抗Ang-2、αvβ1和MMP-2多克隆抗體購自Abcam公司。

1.2 HUVECs培養和分組 HUVECs接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，細胞貼壁生長，將培養基置于5%CO2、37 ℃培養箱中。細胞長至融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。HUVECs形態為多角形，單層緊密排列。當細胞匯合度達到80%左右時，終止消化，用移液器頭端吹打培養瓶底部，成為細胞懸液。將細胞接種于12孔培養板中(每孔200 μl，密度約為105/ml細胞)，將其分為四組：①對照組(NC):未干預的HUVECs；②空腺病毒轉染組(Ad)：空腺病毒(50 pfu/ml)轉染HUVECs；③Ang-2腺病毒轉染組(Ad-Ang-2)：Ang-2腺病毒(50 pfu/ml)轉染HUVECs；④αvβ1 siRNA+Ang-2腺病毒轉染組(Ad-αvβ1 siRNA+Ang-2)：αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒(各50 pfu/ml)共同轉染HUVECs。每組6個復孔，然后將培養板置于培養箱中72 h。

1.3 Western blot檢測蛋白表達水平 將培養板從培養箱中取出，丟掉上清液，加入蛋白裂解液，移至1.5 ml離心管中，離心10 min，將上清液移至新的離心管中。于-80 ℃冰箱中保存備用。用Western blot法檢測Ang-2、αvβ1和MMP-2蛋白表達水平，以化學發光模式測定結果，分別與GAPDH蛋白條帶灰度比值作為半定量結果。為方便分析，對照組與GAPDH蛋白條帶灰度比值轉換為1，其余組等比例轉換。

2 結 果

2.1 四組Ang-2蛋白表達水平比較 Western blot法檢測Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒轉染HUVECs對Ang-2表達水平的影響。結果顯示空腺病毒轉染HUVECs后，Ang-2表達水平較對照組無統計學差異(P>0.05)。Ang-2腺病毒轉染HUVECs后，Ang-2表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，說明Ang-2腺病毒轉染有效，能促進HUVECs表達Ang-2。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒共同轉染HUVECs后，Ang-2表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，但與Ang-2腺病毒轉染組比較無統計學差異(P>0.05)，說明αvβ1 siRNA不影響Ang-2表達(圖1)。

注：與NC組比較，*P<0.05

2.2 四組αvβ1蛋白表達水平比較 Western blot法檢測Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒轉染HUVECs對αvβ1蛋白表達水平的影響。結果顯示空腺病毒轉染HUVECs后，αvβ1表達水平較對照組無統計學差異(P>0.05)。Ang-2腺病毒轉染HUVECs后，αvβ1表達水平較對照組無統計學差異(P>0.05)，說明Ang-2腺病毒轉染HUVECs后能使Ang-2表達水平升高但不影響αvβ1水平。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒共同轉染HUVECs后，αvβ1表達水平較對照組明顯下降(P<0.05)，說明αvβ1 siRNA腺病毒轉染有效，能抑制HUVECs表達αvβ1(圖2)。

注：與NC組比較，*P<0.05

2.3 四組MMP-2蛋白表達水平比較 Western Blot法檢測Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒轉染HUVECs對MMP-2表達水平的影響。結果顯示空腺病毒轉染HUVECs后，MMP-2表達水平較對照組無統計學差異(P>0.05)。Ang-2腺病毒轉染HUVECs后，MMP-2表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，說明Ang-2腺病毒轉染后能促進HUVECs表達Ang-2的同時還能促進MMP-2表達。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒轉染HUVECs后，MMP-2蛋白表達水平較Ang-2腺病毒轉染組明顯下降(P<0.05)，說明αvβ1 siRNA腺病毒轉染后低水平的αvβ1能抑制HUVECs表達MMP-2(圖3)。

注：與NC組比較，*P<0.05；與Ad-Ang-2組比較，△P<0.05

3 討 論

動脈粥樣硬化作為冠心病發病的基礎，其發生是多種因素參與的長期慢性過程，主要涉及血管內皮損傷、內皮下脂質沉積、炎性因子激活、單核細胞激活和遷移以及平滑肌細胞增殖和遷移等[5-6]。MMP-2作為基質金屬蛋白酶家族的主要成員，其主要作用是降解細胞外基質，能夠降解膠原、纖維蛋白和彈性蛋白，破壞基底膜，有利于脂質在內皮下沉積、單核細胞遷移至內皮下形成巨噬細胞，巨噬細胞內吞脂質形成泡沫細胞，同時各種生長因子刺激血管平滑肌細胞增殖，引起動脈粥樣硬化斑塊形成[7-8]。MMP-2還可以促進白介素、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的釋放，加重炎癥反應，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成[9]。由此可見MMP-2在促進動脈粥樣硬化斑塊形成過程中具有重要作用。MMP-2在動脈粥樣硬化斑塊的肩部區域表達明顯增加，通過特異性分解Ⅳ型膠原，降解細胞外基質，能夠降低斑塊的穩定性，引起斑塊破裂，導致急性冠脈綜合征的發生[10-11]。因此，MMP-2能促進動脈粥樣硬化斑塊形成和降低斑塊穩定性。

Ang-2是一種具有血管活性的因子，參與血管的新生到成熟，但其首先是在腫瘤細胞中發現，目前已在胃癌、肝癌、乳腺癌、膠質瘤、非小細胞肺癌等多種腫瘤組織中檢測到Ang-2的存在，尤其是在許多惡性腫瘤組織中高表達，認為其具有促進腫瘤組織快速增殖、轉移和侵襲的作用[12-13]。Hu等[14]首先通過分析大量人腦膠質瘤組織，發現腫瘤侵襲區域Ang-2表達量均明顯升高，同時MMP-2的表達水平也明顯增加，兩者具有明顯的相關性。體外實驗發現Ang-2重組病毒質粒轉染的膠質瘤細胞可引起MMP-2的表達量明顯增加，同時腫瘤的侵襲能力也相應增強。相反，加入MMP-2抑制劑，能明顯抑制腫瘤的侵襲。這些結果表明，Ang-2在誘導腫瘤細胞浸潤中起著關鍵作用，并且這種作用可能是通過促進MMP-2的表達引起的。Hu等[4]隨后通過人腦膠質瘤組織發現，Ang-2可能通過與整合素αvβ1結合促進MMP-2表達和分泌。

Ang-2除了在血管新生和腫瘤轉移中起作用，還影響動脈粥樣硬化斑塊形成和穩定性[15-17]。Theelen等[18]通過高脂飲食構建動脈粥樣硬化小鼠模型，腹腔注射Ang-2阻斷性抗體來阻斷Ang-2與其受體結合，從而抑制Ang-2的生理功能。結果發現Ang-2的生理作用被阻斷后，小鼠甘油三酯水平明顯降低，同時還能改善內皮細胞功能和抑制單核細胞遷移，認為Ang-2可促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。Lee等[19]對126例急性冠脈綜合征患者(82例急性心肌梗死和44例不穩定型心絞痛)外周血Ang-2水平進行了分析，并與40例穩定型心絞痛患者和40例健康對照者進行對比，結果顯示急性冠脈綜合征患者Ang-2水平明顯增高，且急性心肌梗死患者升高更明顯。Zeng等[20]通過研究也發現冠心病患者外周血Ang-2表達水平較健康人群明顯升高，血漿Ang-2濃度與冠狀動脈狹窄程度顯著正相關，且冠狀動脈介入治療后血漿Ang-2濃度明顯降低。我們前期對84例急性冠脈綜合征患者(急性心肌梗死患者和不穩定型心絞痛患者各42例)、42例穩定型心絞痛患者和45名健康對照者血漿Ang-2和MMP-2濃度進行分析，發現急性冠脈綜合征患者Ang-2和MMP-2水平均明顯升高，急性心肌梗死患者升高更明顯，且Ang-2與MMP-2水平呈顯著的正相關[21]。

結合Ang-2和MMP-2在腫瘤中的作用，本研究進一步探討內皮細胞Ang-2和MMP-2的相互作用關系。體外培養HUVECs，通過轉染Ang-2腺病毒和αvβ1 siRNA腺病毒來調控Ang-2和αvβ1表達水平，觀察對MMP-2表達的影響。結果顯示Ang-2腺病毒轉染HUVEC后能升高Ang-2水平，提示Ang-2腺病毒轉染有效，還能促進MMP-2蛋白表達，但對整合素αvβ1無影響。當加入αvβ1 siRNA腺病毒抑制αvβ1表達后，MMP-2表達水平也明顯下降。因此,本研究結果發現Ang-2能促進內皮細胞MMP-2的表達，可能通過與整合素αvβ1結合有關。