乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中絲氨酸蛋白酶抑制劑A1表達(dá)及對(duì)預(yù)后判斷的臨床價(jià)值研究

李 歡，王世全，李 鐸

(錦州市婦嬰醫(yī)院乳腺科，遼寧 錦州 121000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其中最常見的類型是浸潤性導(dǎo)管癌[1]，病變的形成涉及多種分子生物學(xué)因子的調(diào)控異常。絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(Serine protease inhibitor A1，SerPinA1)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的重要成員之一，正常機(jī)體的肝細(xì)胞內(nèi)有微量合成，在炎性相關(guān)疾病時(shí)表達(dá)升高，對(duì)炎性因子平衡起一定的調(diào)控作用[2]。近年學(xué)者在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)SerPinA1表達(dá)升高，尤其是上皮源性惡性腫瘤的形成過程中[3]。SerPinA1可能對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖有作用。本研究基于乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中SerPinA1的表達(dá)進(jìn)行研究，探討其在不同臨床病理特征中的表達(dá)差別，分析其對(duì)預(yù)后的判斷價(jià)值，以期為臨床工作提供支持。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2015年1-12月期間確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的患者作為研究對(duì)象，共93例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①均行根治性手術(shù)治療，術(shù)后經(jīng)病理醫(yī)師確診，符合WHO中的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；②原發(fā)腫瘤；③臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行放、化療；②診斷有異議者或伴有其他惡性成分者；③雙原發(fā)癌或多原發(fā)癌。患者均為女性，年齡31～84歲，平均(59.7±6.5)歲，其中組織學(xué)Ⅰ級(jí)12例，組織學(xué)Ⅱ級(jí)60例，組織學(xué)Ⅲ級(jí)21例。留取腫瘤組織作為研究組，留取距腫物邊緣>2 cm乳腺其他象限的非腫瘤性乳腺組織作為對(duì)照組。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)：術(shù)后標(biāo)本常規(guī)經(jīng)中性福爾馬林固定、取材、脫水及石蠟包埋后，切取4 μm切片后置于膠片上，應(yīng)用免疫組化二步法檢測(cè)SerPinA1、人類表皮生長因子受體2(HER-2)和Ki67的表達(dá)。SerPinA1的濃縮液、二抗和DAB均購自武漢博士德生物技術(shù)公司；HER-2和Ki67為工作液，購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。SerPinA1按不同配比濃度先行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇染色效果最佳的濃度(1∶250)用于正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)均手工操作，嚴(yán)格按說明書操作，操作均由同一病理技師完成，設(shè)陽性對(duì)照，減少人為誤差。

結(jié)果由兩位病理主治醫(yī)師應(yīng)用盲法進(jìn)行判讀。SerPinA1的顯色部位為上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿。應(yīng)用著色強(qiáng)度和陽性率二維評(píng)分法進(jìn)行綜合評(píng)分。著色強(qiáng)度：無色為0分，弱為1分，中為2分，強(qiáng)為3分。陽性率：隨機(jī)選擇5個(gè)高倍(400倍)視野，計(jì)算陽性率，陽性率<5%為0分，5%～25%為1分，以26%～50%為2分，以51%～75%為3分，以>75%為4分。著色強(qiáng)度和陽性率的評(píng)分相乘為最終評(píng)分，總分范圍0～12分。以≤4分為陰性，以>4分為陽性。計(jì)算每張切片SerPinA1表達(dá)的陽性率。HER-2的判讀參考乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2019版)[4]，以陰性和+為陰性，以為陽性。對(duì)的病例行FISH檢測(cè)。Ki67的顯色部位是細(xì)胞核，以黃色-棕褐色為陽性，選擇熱點(diǎn)區(qū)進(jìn)行觀察，共選擇3個(gè)400倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，取平均值，Ki67的陽性率亦稱為增殖指數(shù)。

1.2.2 熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)：對(duì)腫瘤中免疫組化顯示HER-2為的病例行FISH檢測(cè)。步驟及判讀參考乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2019版)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，率的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析應(yīng)用K-M生存分析，并應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中檢索結(jié)果 GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)SerPinA1在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中檢索結(jié)果

2.2 兩組中SerPinA1陽性率比較 研究組中SerPinA1表達(dá)的陽性率明顯高于對(duì)照組。見表1(圖2)。

表1 兩組中SerPinA1表達(dá)陽性率比較[例(%)]

2.3 SerPinA1在研究組不同臨床病理特征分組中表達(dá)的比較 研究組中SerPinA1的表達(dá)在不同腫瘤最大徑、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2表達(dá)和組織學(xué)分級(jí)的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2(圖3)。

表2 SerPinA1在研究組不同臨床病理特征分組中表達(dá)的比較[例(%)]

圖3 研究組中HER-2陽性的表達(dá)(FISH法，×1000)

2.4 研究組中SerPinA1與Ki67的相關(guān)性 研究組中Ki67增殖指數(shù)表達(dá)范圍是5%～80%，平均(34.3±5.4)%。Spearman相關(guān)分析顯示SerPinA1與Ki67呈正相關(guān)性(r=0.66，P=0.021)。見圖4、5。

圖4 研究組中Ki67的表達(dá)(IHC 二步法，× 200)

圖5 研究組中SerPinA1與Ki67的相關(guān)性

2.5 研究組中SerPinA1的表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系 患者均行術(shù)后60個(gè)月生存時(shí)間的隨訪，截止時(shí)間點(diǎn)為2020年12月31日。其中生存56例，死亡33例，失訪4例。行K-M生存分析顯示SerPinA1的表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)(χ2=4.32，P=0.019)，即SerPinA1高表達(dá)的患者生存時(shí)間短，預(yù)后差。見圖6。

圖6 SerPinA1與生存時(shí)間的關(guān)系

3 討 論

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的病變形成與基因表達(dá)失調(diào)有關(guān)[5]。SerPin是眾多腫瘤相關(guān)基因中的成員，目前共發(fā)現(xiàn)有9個(gè)家族，其中最重要的因子是SerPinA1，也是學(xué)者關(guān)注最多的因子，具有高度的保守結(jié)構(gòu)。研究認(rèn)為SerPinA1在細(xì)胞外基質(zhì)的降解(調(diào)節(jié)MMPs)、炎性因子的釋放和細(xì)胞的轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用[6-7]。SerPinA1主要在肝細(xì)胞內(nèi)合成，其在肝細(xì)胞中表達(dá)較高，具有急性時(shí)相蛋白的作用，但是在人體其它正常上皮成份中表達(dá)極少[8]。研究顯示在惡性轉(zhuǎn)變的上皮細(xì)胞中SerPinA1的表達(dá)可以升高[9-12]。SerPinA1高表達(dá)可以增加腫瘤細(xì)胞的增殖、出芽，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移[13-15]。SerPinA1通過保守機(jī)制抑制靶酶，SerPinA1可作為“捕鼠器”的作用，其中的蛋白酶是“小鼠”，當(dāng)?shù)鞍酌缸R(shí)別誘導(dǎo)因子后形成可逆的復(fù)合物，形成對(duì)凋亡的抑制作用[11]。

本研究結(jié)果顯示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中SerPinA1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示SerPinA1在腫瘤性病變時(shí)分泌增加，參與腫瘤的形成。結(jié)果顯示腫瘤中SerPinA1的表達(dá)在不同腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及組織學(xué)分級(jí)的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示SerPinA1參與腫瘤的生長和細(xì)胞增殖，對(duì)腫瘤的局部侵襲和直接蔓延有重要的促進(jìn)作用。SerPinA1在正常乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)極低，但在上皮細(xì)胞惡變過程中SerPinA1的表達(dá)明顯升高，可能與腫瘤微環(huán)境中的低氧和低pH值有關(guān)，這些因素均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌更多的SerPinA1。SerPinA1高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖作用，并能使腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物的影響，使腫瘤細(xì)胞具有旺熾性增殖的特征，腫瘤細(xì)胞增殖加速，腫瘤生長加速[16]。也有觀點(diǎn)顯示SerPinA1通過磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)與CyclinD3的活性，使細(xì)胞處于高度活躍狀態(tài)[17-19]。SerPinA1能促進(jìn)染色體的重塑，也是其調(diào)節(jié)腫瘤形成的重要因素之一。SerPinA1對(duì)MMPs的調(diào)節(jié)可能是對(duì)轉(zhuǎn)移調(diào)控的重要途徑，SerPinA1高表達(dá)可以引起基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9的分泌，使細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜有效降解，為轉(zhuǎn)移提供必要的條件[20]。研究顯示SerPinA1的表達(dá)與HER-2表達(dá)密切相關(guān)，提示SerPinA1可能與基于HER-2為靶點(diǎn)的治療有關(guān)。相關(guān)分析顯示SerPinA1與Ki67指數(shù)呈正相關(guān)性，證實(shí)了SerPinA1對(duì)腫瘤細(xì)胞繁殖及腫瘤生長的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到SerPinA1的表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)，提示檢測(cè)SerPinA1的表達(dá)可能對(duì)判斷預(yù)后有一定價(jià)值，即SerPinA1高表達(dá)的患者預(yù)后差，但是SerPinA1作為預(yù)后因子尚需要進(jìn)行大樣本、多因素及多中心的分析后進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，SerPinA1在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)升高，與腫瘤的形成和進(jìn)展有關(guān)。術(shù)后檢測(cè)SerPinA1的表達(dá)對(duì)判斷預(yù)后有一定價(jià)值。