UPLC-MS/MS法測定五倍子洗劑中5種指標性成分的含量

張 群，陳 瑜，支曉偉，須秋萍，楊英楠，趙 亮，李盛建 （. 上海市寶山區老年護理院，上海 00435；. 上海市寶山區羅店醫院，上海 0908）

五倍子洗劑是我院依據中醫藥理論為基礎應用于臨床多年的協定方，主要用于復雜性肛瘺術后治療，能促進術后創面的愈合，減輕術后水腫、疼痛、排尿障礙等不良反應[1-3]。五倍子洗劑由五倍子、槲寄生、黃柏、紫花地丁、大黃等八味中藥經水煎提取制備而成。現有的五倍子洗劑是采用傳統方法水煎劑直接處理得到，雖然臨床應用多年，但是其基礎研究薄弱，缺乏制劑相應規范化的提取標準，且存在質量差異，制劑穩定性受到很大影響。隨著中藥質量標準的進步和發展，有必要對其質量控制進行進一步的深入研究。根據2020年版《中國藥典》中藥材“含量測定”項中規定，五倍子、槲寄生、黃柏、紫花地丁和大黃的指標性成分分別為沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸[4]。目前已有研究對五倍子、黃柏、大黃等單味藥材中的指標性成分進行含量測定[5-7]，未有對五倍子洗劑指標性成分含量同時測定的報道。

質譜聯用技術具有專屬性強，靈敏度高，準確度好的特點，已經越來越多的用于中藥中多種成分的檢測[8-10]。本研究基于2020年版《中國藥典》，建立了一種穩定、快速的，同時測定五倍子洗劑中沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸含量的UPLC-MS/MS法，為五倍子洗劑的質量控制提供一種可靠的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

6 460 Triple Quad LC/MS高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），十萬分之一電子天平（力辰科技）。

1.2 試藥

五倍子（批號：201101，產地：安徽），白礬（批號：200501，產地：安徽），荊芥（批號：200102，產地：江蘇），紫花地丁（批號：200902，產地：山東），黃柏（批號：200601，產地：四川），大黃（批號：200601，產地：甘肅），槲寄生（批號：200501，產地：遼寧），炒五靈脂（批號：200401，產地：陜西）；沒食子酸（批號：5946，純度≥98.0%）、紫丁香苷（批號：7568，純度≥98.0%）、黃柏堿（批號：7682，純度≥98.0%）、秦皮乙素（批號：127，純度≥98.0%）、大黃酸（批號：5946，純度≥98.0%）、苦杏仁苷（批號：5930，純度≥98.0%）均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純（SIGMA公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×150 mm, 2.7 μm），流動相：A相為0.2%甲酸溶液，B相為乙腈；線性梯度洗脫，洗脫程序如下：0～1.5 min，10 % B；1.5～7 min，10%～90% B：流速：0.3 ml/min，平衡時間：3 min，柱溫：30 ℃；進樣量：2 μl。

2.2 質譜條件

采用AJS ESI動態多反應離子監測模式(DMRM)進行二級掃描；離子源參數設置：干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化器壓力40 psi（1 psi=6 894.7 Pa）；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細管電壓4 000 V；5種成分及內標的質譜參數及保留時間見表1，化學結構式見圖1，典型MRM色譜圖見圖2。

圖1 5種指標性成分及內標物的化學結構式

圖2 5種指標性成分及內標的典型色譜圖

表1 5種指標性成分以及內標的質譜參數

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液

精密稱取沒食子酸10.25 mg、紫丁香苷10.31 mg、黃柏堿10.53 mg、秦皮乙素10.14 mg、大黃酸10.54 mg、苦杏仁10.43 mg置于10 ml容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻備用，即得對照品儲備液，濃度分別為沒食子酸1.025 mg/ml，大黃酸1.031 mg/ml，紫丁香苷1.053 mg/ml，秦皮乙素1.014 mg/ml，黃柏堿1.054 mg/ml，苦杏仁1.043 mg/ml。精密移取單個對照品儲備液適量，置于10 ml容量瓶中混合，加甲醇定容至刻度，得混合對照品儲備液。精密移取混合儲備液適當體積于10 ml容量瓶中，用甲醇依次逐級梯度稀釋。配成混合對照品系列溶液，濃度分別為沒食子酸：0.153 8～15.38 μg/ml，大黃酸: 1.054～105.4 ng/ml，紫丁香苷：10.31～1 031 ng/ml，秦皮乙素：50.00～5 000 ng/ml，黃柏堿：5.265～526.5.5 ng/ml，苦杏仁:1 043 ng/ml，上述溶液保存于4 ℃冰箱待用。

2.3.2 供試品溶液

按五倍子洗劑配方，分別稱取五倍子、白礬、荊芥、紫花地丁、黃柏、大黃、槲寄生、炒五靈脂15 g，加入2 500 ml純凈水，浸泡2 h，煎煮30 min，過濾，取適量濾液稀釋100倍，經0.22 μm濾膜過濾，取續濾液即得五倍子洗劑供試品溶液；取供試品溶液900 μl，加入內標溶液100 μl，混勻，待分析。

2.4 標準曲線及線性關系考察

分別精密移取“2.3” 項中配置好的混合對照品系列溶液 900 μl，加入內標溶液100 μl，混勻，按“2.1”和“2.2”項下UPLC-MS/MS條件進樣分析，記錄色譜圖，計算各成分與內標峰面積的比值。以添加濃度(X)為橫坐標，各成分與內標峰面積的比值(Y)為縱坐標，進行線性回歸。以信噪比大于10(S/N＞10)作為定量下限，S/N＞3作為檢測下限。檢測限、定量限、回歸方程、線性范圍及相關系數見表2，結果表明5種成分在相應的線性范圍內呈良好的線性關系。

表2 五倍子中5種指標性成分的標準曲線 (n=5)

2.5 精密度試驗

取混合對照品高（沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的濃度分別為3.076、206.2、105.3、1.014、21.08 ng/ml）、中（濃度分別為1 538、103.1、52.65、507.0、10.54 ng/ml）、低（濃度分別為769.0、51.55、26.32、253.5、5.270 ng/ml）三個濃度，按“2.3.2”項下方法處理樣品，并按“2.1”和“2.2”項下UPLC-MS/MS條件進樣分析，連續3 d測定，記錄各成分色譜峰面積，計算濃度，考察日內和日間精密度，結果沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸在低濃度下的日內精密度RSD值分別為1.92%、0.28%、1.09%、1.97%、1.46% (n=3)，日間精密度RSD值分別為5.57%、1.82%，4.18%、4.08%、2.08%；中濃度下的日內精密度RSD值分別為1.55%、0.96%、1.09%、1.97%、0.87% (n=3)，日間精密度RSD值分別為1.61%、2.39%，1.33%、2.35%、4.68%；高濃度下的日內精密度RSD值分別為1.08%、1.77%、1.20%、1.48%、1.31% (n=3)，日間精密度RSD值分別為1.41%、3.11%，1.50%、2.96%、1.89%、7.20%；結果顯示該方法精密度符合方法學要求，儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密取同一批五倍子洗劑溶液，共6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”項下條件進樣分析，記錄各成分色譜峰面積，計算濃度，沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的濃度分別為1 968、99.87、66.23、892.4、10.09 ng/ml，RSD分別為1.69%、4.11%、3.49%、4.09%、2.5%，結果表明該方法的重復性良好。

2.7 穩定性試驗

按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、3、7、12、24 h測定供試品溶液中沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的含量，考察供試品常溫放置穩定性，沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的RSD分別為2.58%、4.26%、4.86%、1.24%、5.26%，結果表明樣品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率

精密量取五倍子供試品溶液，加入適量對照品溶液，平行操作6份，按“2.3.2”項下方法制備溶液，測定沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的含量，計算加樣回收率（見表3），結果表明該方法回收率良好。

表3 五倍子洗劑加樣回收試驗結果

2.9 樣品測定

精密量取3批次五倍子供試品溶液，按“2.3.2”項下方法制備溶液，測定沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的含量，結果如表4所示。

表4 五倍子洗劑中5種指標性成分含量測定結果

3 討論

3.1 稀釋倍數的確定

五倍子洗劑中不同成分的含量差異較大，不同稀釋倍數處理后進樣，部分成分超出標準曲線線性范圍，如沒食子酸含量過高，大黃酸含量過低，進一步擴大線性范圍會導致線性方程r系數不達標。因此，本實驗針對稀釋倍數進行了探索，五倍子洗劑稀釋100倍處理后，6種成分的濃度均在線性范圍內。

3.2 質譜條件的選擇

前期采用高效液相色譜法檢測五倍子洗劑中多個化學成分，但五倍子洗劑的各成分復雜，待測成分相互干擾，因此在色譜柱中分離時間較長，難以獲得分離效果較好的色譜系統；同時各成分的含量差異較大，含量偏低的成分如大黃酸、紫丁香苷，其響應信號較低，不能滿足定量要求。故本實驗采用高選擇性和高靈敏度的液質聯用技術測定五倍子洗劑中5種指標性成分的含量。由于各成分在結構方面存在差異，為了兼顧各成分測定以使其具有較高的靈敏度，本實驗采用正負離子切換模式同時定量5種成分，并優化碎片電壓和碰撞能量，紫丁香苷和黃柏堿在正離子掃描模式下響應更強，而沒食子酸、秦皮乙素、大黃酸在負離子掃描模式下的響應值更高。

3.3 色譜條件的選擇

由于五倍子洗劑中沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的極性差異較大，預試驗考察了不同色譜柱Waters HSS T3（2.10 mm×100 mm,2.5 μm）、BEH Amide（2.1 mm×100 mm, 1.7 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×150 mm,2.7 μm）和不同流動相體系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液）對成分響應和峰形的影響。結果發現，Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱與乙腈-0.2%甲酸流動相組合后，沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的響應強度和峰形較好，并在7 min內完成分析。

4 結論

本實驗建立了同時測定沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸6 種指標性成分UPLCMS/MS方法，該方法樣品前處理簡便，結果準確穩定、重現性好，分析時間短，對五倍子洗劑的質量控制研究具有重要意義，為五倍子洗劑的進一步開發奠定基礎。