鼻淵凈膠囊的HPLC指紋圖譜研究

程艷芹，朱 姍，李明春，張玉杰，付青姐 （中國人民解放軍海軍第九七一醫院藥劑科，山東 青島，266071）

鼻淵凈膠囊為純中藥內服制劑[批準文號：總制字（2016）F405004]，由蒼耳子、辛夷、連翹、白芷、羌活、野菊花等六味中藥組成，具有散風消炎、宣通鼻竅、稀化鼻竇與氣管粘稠分泌物的功效，主要用于鼻淵的治療。由于該制劑原有質量標準制定年代久遠，質量控制僅有白芷一味藥材的薄層鑒別，主要藥味均無含量測定項，不能較好地反映制劑質量，本課題組前期對其原有的工藝參數進行了優選[1]，并進行了質量標準研究。新的質量標準增加了辛夷、連翹、羌活、野菊花四味藥的薄層定性鑒別，并建立了辛夷中木蘭脂素、連翹中連翹苷、白芷和羌活中歐前胡素、野菊花中蒙花苷等主要成分的HPLC含量測定[2]，本研究在此基礎上，建立了鼻淵凈膠囊的HPLC指紋圖譜，擬從多成分角度對其質量進行全面控制，進一步保證制劑的質量均一和臨床用藥安全。

1 材料與試藥

1.1 實驗儀器

Agilent 1 260高效液相色譜儀，含G1329A自動進樣器、G4212B DAD檢測器（美國，Agilent公司）；JM-B2102型電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）；FA1605型電子天平（上海橫平儀表廠）；KH-100B型超聲波清洗器（昆山和創超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑

10個批次(標記為S1～S10)的鼻淵凈膠囊樣品（批號：150901、150902、150904、150905、150910、150913、150916、150920、150921、150923，本院制劑室自制）；連翹苷（批號：110753-201314）、蒙花苷（批號：110805-200508）、木蘭脂素（批號：110780-201007）、歐前胡素（批號：111730-201307）、異歐前胡素（批號：111640-201005）等對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為自制純水；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備[3-8]

2.1.1 供試品溶液

取鼻淵凈膠囊內容物適量，研碎，精密稱取粉末約1 g置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，加甲醇補足損失重量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液

分別取紫花前胡苷、連翹苷、蒙花苷、木蘭脂素、歐前胡素和異歐前胡素對照品各10 mg，精密稱定，分別置10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密量取1 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 單味藥材溶液

分別取野菊花、連翹、蒼耳子、辛夷、羌活、白芷單味藥材適量，按照鼻淵凈膠囊的制備方法及供試品溶液的制備方法，制備各單味藥的樣品溶液。

2.2 色譜條件與方法學考察

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脫：0～5 min，20% A；5～15 min，20%～30% A；15～35 min，30%～40% A；35～50 min，40%～50% A；50～70 min，50%～55% A；70～80 min，55% A；流速：1.0 ml/min；檢測波長210 nm；進樣量10 μl。

2.2.2 方法學考察[9～20]

精密度試驗：取鼻淵凈膠囊S1號樣品（批號：150901）膠囊內容物，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，用“2.2.1”項下的色譜條件測定，連續進樣6次，記錄指紋圖譜，以峰9為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。

重復性試驗：取鼻淵凈膠囊S1號樣品（批號：150901）膠囊內容物，共6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，用“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，以峰9為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。

穩定性試驗：取同一S1號樣品（批號：150901）的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h依法進樣測定，以峰9為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。

2.3 指紋圖譜的建立、相似度的評價及部分共有峰的歸屬

取鼻淵凈膠囊S1～S10號共10批樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，用“2.2.1”項下色譜條件測定，將圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”進行分析。

根據10批供試品溶液的色譜峰生成參照圖譜，選擇參照圖譜中峰面積大于500且分離度較好的峰為共有指紋峰，分析確定鼻淵凈膠囊的共有指紋峰。

釆用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》評價10批鼻淵凈膠囊的圖譜的相似性，并進行綜合評價。

3 結果

3.1 方法學考察

精密度試驗結果顯示各共有峰平均相對保留時間的RSD為0.62%，平均相對峰面積的RSD為1.17%，在該方法下的精密度良好；重復性試驗結果顯示各共有峰平均相對保留時間的RSD為0.29%，平均相對峰面積的RSD為1.15%，在該方法下重復性良好；穩定性試驗結果顯示各共有峰平均相對保留時間的RSD為0.90%、平均相對峰面積的RSD為1.10%，樣品在12 h內穩定。

3.2 指紋圖譜的建立

以批號150 901（S1）的指紋圖譜作為參照譜，多點校正，采用中位數法生成對照指紋圖譜，結果見圖1。

圖1 10批樣品的HPLC特征圖譜疊加圖

3.3 確定共有指紋峰

分析結果確定鼻淵凈膠囊有20個共有指紋峰，其中峰9為鼻淵凈膠囊的指標成分木蘭脂素，該峰吸收信號最強、保留時間適中，峰形較好且穩定，故將其作為參照峰。鼻淵凈膠囊指紋圖譜見圖2。

圖2 鼻淵凈膠囊HPLC指紋圖譜

3.4 共有指紋峰的相對保留時間及相對峰面積

比較10批鼻淵凈膠囊的色譜圖，以木蘭脂素峰（峰9）的保留時間和色譜峰面積為1，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表1和表2。

表1 10批次鼻淵凈膠囊指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批次鼻淵凈膠囊指紋圖譜共有峰的相對峰面積

3.5 指紋相似度評價

指紋相似度在0.9～1.0之間，各批次之間的相似性較強，說明鼻淵凈膠囊的制備工藝及樣品分析方法穩定可行，相似度結果見表3。

表3 10批次鼻淵凈膠囊HPLC指紋圖譜相似度

3.6 部分共有峰的鑒定及歸屬分析

3.6.1 共有峰的鑒定

采用對照品對照法對共有峰進行確認，取“2.1”項下配制的各對照品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進行檢測，在對照品溶液保留時間處，供試品溶液的色譜峰與對照品色譜峰的在線UV圖一致，由此來判斷共有峰化學成分的歸屬。通過此方法，判斷4號峰為連翹苷，5號峰為蒙花苷，9號峰為木蘭脂素，15號峰為歐前胡素，17號峰為異歐前胡素（見圖3）。

圖3 鼻淵凈膠囊與蒙花苷HPLC疊加圖及蒙花苷的UV光譜圖

3.6.2 藥味歸屬分析

采用各單味藥陽性對照試驗，取“2.1”項下各單味藥材溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件進行測定。通過比較各色譜峰的保留時間和UV光譜圖，對鼻淵凈膠囊樣品中共有峰的來源進行追溯。結果表明，峰1、2、4、6、7來自連翹，峰5來自野菊花，峰8～13來自辛夷，峰15、17、20來自白芷，其中峰17、20為羌活和白芷的共有峰。

4 討論

在預實驗中，曾嘗試多種不同的溶劑系統作為流動相，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸、乙腈-乙酸、乙腈-磷酸，發現選用甲醇-水時，基線總是漂移；選用乙腈-水時，乙腈比甲醇的洗脫效果更明顯，且加入酸溶液并不能改善峰型、基線平穩，各峰的峰型和分離度均良好，故選擇乙腈-水作為流動相。經過對供試品采用DAD檢測器進行全波長掃描發現，在210 nm波長下供試品溶液圖譜的信息量較多、各吸收峰強度較大，故最終選擇210 nm作為鼻淵凈膠囊HPLC指紋圖譜的檢測波長。

對中成藥的評價需要全面方能準確反映制劑質量。本研究采用HPLC法，建立了以木蘭脂素為參照物的鼻淵凈膠囊的指紋圖譜，標定了21個共有指紋峰，指認了5個成分，10批次樣品指紋圖譜整體的相似性結果在0.9以上。在此次建立的鼻淵凈膠囊HPLC-UV指紋圖譜中，蒼耳子藥材的特征性成分表達很少，可能是因為其特征性成分在該波長下紫外吸收較少，或者是受其他成分的影響未能表達，此不足考慮在以后的研究中運用液質聯用技術對其成分進行分析與檢測來彌補[21-22]，從而為鼻淵凈膠囊的質量評價提供更全面可靠的依據。