高效液相色譜法考察8種常用對照品溶液的穩定性

龔 亞，李 敏，曹 健，樊 莉 （陸軍軍醫大學第二附屬醫院藥劑科，重慶 400037）

對照品系指國家藥品標準中用于鑒別、檢查、含量測定、雜質和有關物質檢查等的標準物質[1]。《中國藥典》中并沒有明確規定對照品溶液的存放有效期，但《中國藥典》和《藥品生產質量管理規范》（GMP）均要求使用單位應對對照品溶液的穩定性和使用效期進行驗證，通過研究結果來確定內控效期[1-7]。本實驗結合日常檢驗工作的使用率、制劑中間品和成品抽檢的周期，挑選5種制劑（維生素E珍珠乳膏、新面醑、復方替硝唑溶液、磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑和地塞米松磷酸鈉滴鼻液），涉及8種常用的對照品（維生素E、甲硝唑、氯霉素、水楊酸、替硝唑、醋酸氯己定、磺胺嘧啶和地塞米松磷酸酯），按照相應的質量標準方法進行測定[8-14]，考察各對照品儲備液在2～10 ℃冰箱中的穩定性，為存放效期提供必要依據，從而規定對照品儲存的內控時間[15-18]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1 260 型高效液相色譜儀（包括脫氣機、四元泵、自動進樣系統、G7114A紫外檢測器、Chemstation工作站，美國Agilent公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（包括脫氣機、四元泵、自動進樣系統、G1314B紫外檢測器、Chemstation工作站，美國Agilent公司）；PHS-3C型精密 pH計（上海雷磁儀器廠）；ME235S電子天平（德國賽多利斯）；EX225DZH電子天平（美國奧豪斯）。

1.2 試藥

對照品維生素E（批號10062-0007，純度99.2%）、甲硝唑（批號100191-201808，純度100.0%）、氯霉素（批號130555-201203，純度99.8%）、水楊酸（批號100106-201104，純度99.9%）、替硝唑（批號100336-201704，純度100.0%）、醋酸氯己定（批號100183-201003，純度96.2%）、磺胺嘧啶（批號100026-201404，純度99.7%）、地塞米松磷酸酯（批號101116-201102，純度98.6%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（霍尼韋爾，美國）；磷酸、磷酸二氫鉀、鹽酸、醋酸銨、三乙胺為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 維生素E珍珠乳膏（維生素E）色譜條件[8-9]

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇，流速為1.5 ml/min，檢測波長為284 nm，進樣量為10 μl。

2.1.2 新面醑（甲硝唑、氯霉素、水楊酸）色譜條件[10-11]

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.04%磷酸溶液（V∶V=47∶53），流速為1.0 ml/min，檢測波長為284 nm，進樣量為10 μl。

2.1.3 復方替硝唑溶液（替硝唑、醋酸氯己定）色譜條件[12]

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇為流動相A，以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH3.5）（V∶V=20∶80）為流動相B，梯度洗脫(0～8 min，0%～55% A；8～15 min，55% A；15～15. 1 min，55%～0% A；15. 1～20 min，0% A)，流速為1.0 ml/min，檢測波長為280 nm，進樣量為10 μl。

2.1.4 磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑（磺胺嘧啶）色譜條件[13]

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.3%醋酸銨溶液（V∶V=20∶80），流速為1.0 ml/min，檢測波長為260 nm，進樣量為10 μl。

2.1.5 地塞米松磷酸鈉滴鼻液（地塞米松）色譜條件[14]

色譜柱：Hypersil BDS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.75%三乙胺溶液（磷酸調pH 至3.0）-甲醇-乙腈（V∶V∶V= 55∶40∶5），流速為1.0 ml/min，檢測波長為242 nm，進樣量為10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 維生素E對照品溶液

精密稱取維生素E對照品約10 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml中約含維生素E 0.2 mg的對照品溶液。

2.2.2 甲硝唑、氯霉素、水楊酸混合對照品溶液

精密稱取甲硝唑、氯霉素對照品各約10 mg，分別置10 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；另精密稱取水楊酸對照品約12.5 mg，置100 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述甲硝唑、氯霉素對照品稀釋液各5 ml、水楊酸對照品稀釋液10 ml，置于同一25 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml中約含甲硝唑、氯霉素和水楊酸分別為0.2 mg、0.2 mg和0.05 mg的混合對照品溶液。

2.2.3 替硝唑、醋酸氯己定混合對照品溶液

精密稱取替硝唑對照品約10 mg、醋酸氯己定對照品約10 mg置于同一50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋成每1 ml中約含替硝唑、醋酸氯己定各0.2 mg的混合對照品溶液。

2.2.4 磺胺嘧啶對照品溶液

精密稱取磺胺嘧啶對照品約12.5 mg，置25 ml量瓶中，加稀鹽酸1 ml溶解后，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml中約含磺胺嘧啶0.1 mg的對照品溶液。

2.2.5 地塞米松磷酸酯對照品溶液

精密稱取地塞米松磷酸酯對照品約15 mg，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取稀釋液3 ml，置25 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml 約含地塞米松磷酸酯0.036 mg的溶液。

上述對照品溶液均置于具塞的量瓶中，且用封口膜封口，取用后立即冷藏（2～10 ℃）保存，分析前需放至室溫。

2.3 系統適用性試驗

按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。各色譜條件下，各主成分峰分離度均大于1.5，理論板數滿足相應制劑標準要求，且各出峰情況與文獻一致[8-14]。

圖1 系統適用性高效液相色譜圖

2.4 對照品溶液穩定性考察

2.4.1 試驗方法[15-24]

將上述3種對照品溶液在保存0、1、4、7、10、14、21、28、35 d時，與當天新鮮配制的相應對照品溶液按照相應色譜條件分別進樣，分別計算平均峰面積，以當天新鮮配制的對照品溶液計算對照品儲存溶液的含量值。

2.4.2 結果計算[2,20-23]

每個測試時間點的結果都是用新鮮配制的對照品溶液的平均響應值，來重新計算用于研究效期的對照品溶液的標示量，基于下述公式進行計算：

式中，AN和CN表示新鮮配制對照品的峰面積和濃度；AT和CT表示對照品儲存溶液的峰面積和濃度。

2.4.3 判斷標準[2]

各對照品溶液均未出現渾濁、沉淀等異常現象；測試用對照品溶液與新鮮配制的對照品溶液外觀一致；色譜圖中均未出現顯著的雜質峰；每個分析測試點，要求對照品儲存溶液的標示量與零點的差異不得超過2.0%。

2.4.4 結果

上述各類對照品溶液在2～10 ℃冰箱內密封儲存35 d，測試用對照品溶液外觀與新配制對照品溶液一致，未出現渾濁、沉淀等現象；色譜中均未出現顯著的雜質峰，每個分析測試點，對照品溶液的含量變化如圖2所示，維生素E儲存35 d、甲硝唑、氯霉素和水楊酸混合對照品儲存7 d、替硝唑和醋酸氯己定混合對照品儲存35 d、磺胺嘧啶儲存35 d、地塞米松磷酸酯儲存35 d，含量符合要求。結合含量標準要求，在2～10 ℃冰箱中，維生素E對照品、替硝唑和醋酸氯己定混合對照品、磺胺嘧啶對照品、地塞米松磷酸酯對照品溶液的效期可定為35 d，甲硝唑、氯霉素和水楊酸混合對照品溶液定為7 d。

圖2 5種制劑中8種對照品溶液的穩定性

3 討論

對照品溶液是藥品檢驗的重要部分，對照品儲存在冰箱中需要以封口膜封口，減少溶劑的揮發；從冰箱中取出時，需超聲半分鐘或放至室溫，搖勻后再取下封口膜取樣，避免直接打開引起瓶內揮發的溶劑流失，影響測定結果。

考察結果中發現甲硝唑、氯霉素和水楊酸混合對照品溶液穩定性較差，各組分儲存期分別為35、21和7 d。采用三組分單獨配制儲存進行考察，結果發現甲硝唑、氯霉素、水楊酸溶液的儲存時間分別為35、35和10 d，同比混合對照品溶液中，氯霉素穩定性增加，但對水楊酸穩定性改善不明顯，因此推測氯霉素的不穩定性是受其他成分的影響，水楊酸的不穩定性是其固有屬性。

通過對照品儲存溶液穩定性的考察，可為實驗室對照品溶液內控管理提供數據參考，有助于減少對照品的損耗，節約藥品檢驗成本[2,19]。對于某些說明書中附有“本品具有引濕性，建議打開包裝后一次使用完畢”的對照品，可于首次打開后精密稱定多份置于適宜的容量瓶內備用，從而降低檢驗成本，如中國食品藥品檢定研究院在售對照品地塞米松磷酸酯[25]為200 mg/支（單價為390元），即可采用首次開封后，按需求單劑量分裝的方式儲存。

實際生產過程中，環節多而繁瑣，常常中間品和成品抽檢時間跨度長，增加了對照品的消耗。《中國藥典》四部[1]規定，標準物質溶液應臨用前配制，否則應證明其適用性。各類制劑質量標準建立的過程中，一般考察為對照品室溫和4 ℃條件下24 h內的穩定性，這個時間遠遠不能滿足中間品和成品的時間跨度。文中對5種制劑涉及的8種對照品儲存液適用性進行考察，驗證其穩定性，為內控效期的制定提供了依據，基本能夠保證對照品儲備液的效期能夠涵蓋中間品和成品檢驗時間的跨度，完成一批檢品的檢驗。