鹽酸苯海拉明咖啡因復方在大鼠體內的藥動學研究

高 宇，凌 琳，邢信昊，趙 亮，王欣榮，王 彥 （. 解放軍總醫院第七醫學中心，北京 00700；. 浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 00；. 海軍軍醫大學藥學院軍特藥研究中心，上海 00；. 上海市寶山區羅店醫院藥劑科，上海 0908）

暈動病又稱暈動癥、運動病，主要包括暈車、暈船、暈機（又稱空暈病）[1-2]。暈動癥在海軍部隊較為常見，主要發生于對航海環境尚未習服的官兵，遇到海況較差和乘坐較小船只時，暈動癥的發生率會顯著升高[3-4]。目前臨床上用于治療暈動病的藥物非常有限，常用藥物主要包括抗膽堿能藥物（如東莨菪堿）和抗組胺藥物（如苯海拉明、茶苯海明）。但是兩者都有明顯的中樞神經抑制作用，會造成服藥者出現困倦、嗜睡等副作用[1,5]。咖啡因是有效的中樞興奮藥，課題組將鹽酸苯海拉明與咖啡因組成復方，在發揮鹽酸苯海拉明抗暈動病作用的同時，利用咖啡因降低其中樞抑制導致的不良反應。前期課題組開展了鹽酸苯海拉明咖啡因防治暈動病的藥效學研究，沿用了鹽酸苯海拉明用于暈動病防治的常用劑量，即25 mg/人次（70 kg），探索咖啡因的合用劑量，發現鹽酸苯海拉明與咖啡因以1:2.4的比例組成復方效果最佳，既可以保持抗暈動病的效果，又可以克服鹽酸苯海拉明單用導致的嗜睡不良反應。

既往的報道多用HPLC法、毛細管電泳法測定制劑中鹽酸苯海拉明的含量；對生物樣品中鹽酸苯海拉明、咖啡因的測定方法也有研究報道，樣品處理過程大都采用液-液萃取或固相萃取的方法，操作較為煩瑣。本研究建立了UPLC-MS/MS方法測定大鼠血漿中鹽酸苯海拉明與咖啡因的濃度，進一步考察了鹽酸苯海拉明咖啡因復方在大鼠體內的藥動學特點，為該復方制劑的臨床應用提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 UPLC 超高效液相色譜（安捷倫，美國）；Agilent 6 470 Triple Quad 三重四極桿質譜（安捷倫，美國），配備AJS-ESI 噴射流電噴霧離子源、MassHunter 分析工作站；Fresco 21 低溫離心機（賽默飛，美國）；SECURA125-1CN 型十萬分之一電子天平（賽多利斯，德國）；Arium?mini 超純水機（賽多利斯，德國）。

1.2 試藥

對照品鹽酸苯海拉明（中國食品藥品檢定研究院，批號100066-200807，純度99.9%）；內標鹽酸苯海拉明-D6（加拿大TRC，批號8-CNN-25-2，純度98%）；對照品咖啡因（中國食品藥品檢定研究院，批號171215-200608，純度＞98%）；內標咖啡因-D9（美國MTAR，批號90342，純度97%）；甲酸為色譜純（麥克林，中國）；甲醇、乙腈為質譜純（霍尼韋爾，美國）；水為超純水。

1.3 實驗動物

SPF級SD 大鼠，6～8周齡[上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006。合格證編號：20180006019969]。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ACE 3 C18-PFP（3.0 mm×150 mm，3 μm）；流動相系統采用0.1%甲酸水溶液-乙腈（62∶38，V/V），等度洗脫，流速0.4 ml/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μl，分析時間5 min。

2.1.2 質譜條件

采用AJS-ESI離子源，正離子模式，離子源參數設置：干燥氣溫度350℃；干燥氣流速11 L/min；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細管電壓4 000 V。多重反應監測（MRM）的參數設置：鹽酸苯海拉明256.2→167.0（m/z），碎片電壓75 V，碰撞能量10 eV；鹽酸苯海拉明-D6（IS）262.0→167.0（m/z），碎片電壓75 V，碰撞能量10 eV。鹽酸苯海拉明和氘代內標的保留時間均為3.73 min。咖啡因 195.0→138.0（m/z），碎片電壓80 V，碰撞能量20 eV；內標咖啡因-D9（IS）204.0→116.2（m/z），碎片電壓80 V，碰撞能量40 eV。咖啡因和氘代內標的保留時間均為2.35 min。

2.1.3 溶液的配制

（1）鹽酸苯海拉明標準溶液

取鹽酸苯海拉明對照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.0 mg/ml的對照品儲備液；取上述對照品儲備液適量，用甲醇按比例逐級稀釋，配成濃度分別為20～20 000 ng/ml的系列對照品溶液，置4 ℃冰箱保存，備用。

（2）鹽酸苯海拉明-D6內標標準溶液

取鹽酸苯海拉明-D6對照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.0 mg/ml的對照品儲備液；取上述儲備液用甲醇稀釋為50 ng/ml的內標溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

（3）咖啡因標準溶液

取咖啡因對照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.0 mg/ml的對照品儲備液；取上述對照品儲備液適量，用甲醇按比例逐級稀釋，配成濃度范圍分別為300～3×106ng/ml的系列對照品溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

（4）咖啡因D-9內標標準溶液

取咖啡因-D9對照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.0 mg/ml的對照品儲備液；取上述儲備液用甲醇稀釋為2×103ng/ml的內標溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.1.4 血漿樣品前處理方法

取50 μl血漿樣品，依次加入50 μl的鹽酸苯海拉明-D6內標溶液（50 ng/ml）、200 μl的100%乙腈，渦旋1 min，于5 ℃下以12 000 r/min高速離心5 min，取上清液100 μl進樣，用于測定鹽酸苯海拉明的含量。

取50 μl血漿樣品，依次加入100 μl的咖啡因-D9內標溶液（2 000 ng/ml）、700 μl的100%乙腈，渦旋1 min，于5 ℃下以12 000 r/min高速離心5 min，取上清液100 μl進樣，用于測定咖啡因的含量。

2.2 方法驗證結果

2.2.1 選擇性

取空白大鼠血漿樣品、空白大鼠血漿加鹽酸苯海拉明與咖啡因的模擬血漿樣品（鹽酸苯海拉明濃度為100 ng/ml，咖啡因濃度為5×103ng/ml）、定量下限模擬血漿樣品（鹽酸苯海拉明濃度為1 ng/ml，咖啡因濃度為15 ng/ml），以及大鼠給藥后血漿樣品，分別按“2.1.4”項下血漿樣品前處理方法操作，進樣，獲得樣品的色譜圖。結果空白血漿中的內源性成分不干擾待測物和內標出峰，選擇性良好，見圖1。

圖1 血漿中鹽酸苯海拉明、咖啡因及內標典型色譜圖

2.2.2 標準曲線與范圍

取空白大鼠血漿，精密加入不同濃度的對照品溶液，制得濃度為1、5、10、50、100、200、500、1×103ng/ml的鹽酸苯海拉明標準曲線模擬樣品和濃度為15、50、200、1×103、5×103、2×104、1×105、1.5×105ng/ml的咖啡因標準曲線模擬樣品。以血漿中待測物濃度 (X)為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值 (Y)為縱坐標，用1/X權重進行回歸計算，求得鹽酸苯海拉明回歸方程：Y=0.022 662X-0.006 273，r=0.999 6，線性范圍為1～1×103ng/ml；咖 啡 因 回 歸 方 程：Y=0.004 275X-0.017 169，r=0.999 9，線性范圍為15～1.5×105ng/ml。鹽酸苯海拉明與咖啡因標準曲線的線性關系良好，權重因子在整個方法驗證中保持一致。

2.2.3 精密度和準確度

分別制備低、中、高3個濃度水平的質控樣品，其中鹽酸苯海拉明濃度為2.5、250、800 ng/ml，咖啡因濃度為30、5×104、1.2×105ng/ml，每個濃度平行操作5份，連續分析3 d，計算批內、批間的精密度（RSD）及準確度（RE），結果見表1。

2.2.4 基質效應和提取回收率

以6個不同來源的空白大鼠血漿作為基質，分別制備低、中、高3個濃度水平的質控樣品，其中鹽酸苯海拉明濃度為2.5、250、800 ng/ml，咖啡因濃度為30、5×104、1.2×105ng/ml，按“2.1.4”項下進行處理并進樣分析，記錄鹽酸苯海拉明和咖啡因峰面積A和A1；將6個不同來源的空白大鼠血漿提取后，加入待測物和內標溶液，使其最終濃度分別與低、中、高濃度質控樣品的進樣濃度一致，進樣分析，記錄峰面積B和B1；同時配制待測物和內標的純溶液，濃度分別與低、中、高濃度質控樣品的進樣濃度一致，進樣分析，記錄峰面積C和C1。以A/B 的值計算提取回收率，B/C 的值計算基質效應，結果見表1。

表1 鹽酸苯海拉明、咖啡因精密度和準確度、基質效應和提取回收率試驗結果

2.2.5 穩定性

首先通過新鮮配制鹽酸苯海拉明、咖啡因和內標的儲備液1.0 mg/ml，考察對照品儲備液于4 ℃下放置30 d的穩定性；再以空白大鼠血漿作為基質，分別制備低、中、高3個濃度的質控樣品，其中鹽酸苯海拉明濃度為2.5、250、800 ng/ml，咖啡因濃度為30、5×104、1.2×105ng/ml，考察血漿樣品室溫放置穩定性（3 h）、自動進樣器穩定性（4 ℃放置24 h），凍融穩定性（反復凍融3次）、長期穩定性（-80 ℃放置30 d），結果見表2。

表2 鹽酸苯海拉明-咖啡因復方穩定性考察結果

2.3 藥動學研究

2.3.1 樣品采集與測定

SD大鼠24只，隨機分成4組，每組6只，雌雄各半。實驗前禁食12 h不禁水，給藥前稱重并記錄。灌胃組給予鹽酸苯海拉明10 mg/kg、咖啡因24 mg/kg（低劑量組）；鹽酸苯海拉明20 mg/kg、咖啡因48 mg/kg（中劑量組）；鹽酸苯海拉明30 mg/kg、咖啡因72 mg/kg（高劑量組），收集給藥前及給藥后0.08、0.17、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8和12 h的血樣各0.15 ml；靜脈注射組給予鹽酸苯海拉明2 mg/kg、咖啡因4.8 mg/kg，收集給藥前及給藥后0.05、0.13、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、8和12 h的血樣各0.15 ml。所有血樣均放置30 min后，于3 000 r/min 離心5 min，分離得血漿，于-80 ℃保存待測。

2.3.2 大鼠血漿樣本濃度測定結果

對動物實驗中采集的大鼠血漿樣本，按“2.1.4”項下進行處理并進樣分析，將測得的血漿樣品中鹽酸苯海拉明和咖啡因的濃度與相應的采血點時間繪制藥時曲線，見圖2。

圖2 鹽酸苯海拉明-咖啡因復方給藥后大鼠體內血藥濃度

2.3.3 鹽酸苯海拉明和咖啡因的藥動學參數

將對應采血時間測得的藥物濃度采用非房室模型，計算主要藥動學參數，見表3。結果顯示，鹽酸苯海拉明在10～30 mg/kg和咖啡因24～72 mg/kg 3種不同劑量大鼠灌胃給藥后體內呈線性藥動學特征，鹽酸苯海拉明及咖啡因給藥劑量相關系數分別為0.974 3及0.995 3。

表3 鹽酸苯海拉明-咖啡因復方主要藥動學參數（xˉ±s）

同時觀察到雌性和雄性大鼠在藥動學參數上差異較大，通過t檢驗計算兩組數據的P值，以P＜0.05為差異有統計學意義，見圖3。高劑量給藥時，咖啡因在雄性大鼠體內的半衰期（t1/2）及達峰時間（tmax）明顯小于雌性；3個劑量給藥組中雌性大鼠體內鹽酸苯海拉明及咖啡因的達峰濃度（cmax）及藥時曲線下面積（AUC）均大于雄性。

圖3 灌胃組雌雄性大鼠體內鹽酸苯海拉明-咖啡因藥動學參數的差異比較

3 討論

鹽酸苯海拉明是經典的抗暈動病藥物，咖啡因是常用的中樞興奮藥，然而對其開展的藥動學研究較少，文獻報道多為HPLC法、毛細管電泳法測定制劑中的含量[6-8]；亦有生物樣品中鹽酸苯海拉明、咖啡因的測定方法報道，但樣品處理過程大都需要采用液-液萃取或固相萃取的方法[9-14]，較為煩瑣。本文采用UPLC-MS/MS法定量血漿樣品中的鹽酸苯海拉明、咖啡因，采用乙腈作為蛋白沉淀劑，方法簡便易操作。復方中鹽酸苯海拉明咖啡因的處方組成為鹽酸苯海拉明25 mg和咖啡因60 mg，兩藥在大鼠體內的血藥濃度相差較大，鹽酸苯海拉明的血藥濃度很低，咖啡因的血藥濃度相對很高，兩藥同時檢測的難度很大。經過比較樣品前處理的方法，最終確定將二者分開處理，按不同比例進行蛋白沉淀，最終使鹽酸苯海拉明達到1 ng/ml較低的檢測下限，而咖啡因達到15～1.5×105ng/ml較大的線性范圍，該方法能準確定量大鼠血漿樣本中鹽酸苯海拉明和咖啡因的濃度，是一次成功的方法學探索。

藥動學研究顯示，鹽酸苯海拉明和咖啡因的達峰時間均在0.5 h左右、半衰期均在1 h左右，快速起效，鹽酸苯海拉明的抗暈動作用和咖啡因的中樞興奮作用可能同時發揮，可滿足抗暈動病的同時克服嗜睡不良反應的需求。兩藥的藥動學參數在雌雄大鼠間具有明顯差異，可能與激素對代謝的影響有關。人們在日常生活中也會遇到服用鹽酸苯海拉明的同時飲用茶或者咖啡的情況，茶或者咖啡因這樣的中樞興奮飲料中含有咖啡因，本研究考察了咖啡因與鹽酸苯海拉明同服的藥動學特點，對日常生活中藥物的合理應用也有借鑒意義。