基于LC-MS技術的二氫丹參酮Ⅰ抗肝纖維化肝臟代謝組學研究

陶朝陽，朱臻宇，邢心睿，曹 奇，王 輝 （. 西藏軍區總醫院藥物制劑研究中心，西藏 拉薩 85007；. 海軍軍醫大學藥學院，上海 00433）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是以肝內細胞外基質（extracellular matrix protein，ECM）過度沉積和纖維瘢痕形成為特征的慢性肝病，在世界范圍內具有較高的發病率和病死率，持續發展導致肝硬化、肝癌的發生[1]。肝纖維化發病機制復雜，病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、膽汁淤積性肝病等均可能導致慢性肝炎癥，并最終導致肝纖維化[2]。然而，除肝移植外，目前尚無有效治療肝纖維化的方法，針對肝纖維化早期識別和治療對于預防相關負面后果至關重要。鑒于肝臟是人體最大的器官和主要代謝樞紐，探討肝纖維化的代謝特征有望發現新的標志物和治療靶點。

二氫丹參酮Ⅰ（dihydrotanshinone I，DHI）是中藥丹參中的親脂性成分，被認為是一種潛在的治療肝纖維化的藥物，其肝臟保護作用、抗癌作用、抗流感活性、抗炎作用等生物學功能已多次報道[3-5]。在本課題組前期扶正化瘀方抗肝纖維化機制研究中發現DHI是扶正化瘀膠囊的重要藥效物質基礎，也在細胞活性實驗中證明其能顯著抑制細胞活性發揮抗肝纖維化作用[6]。然而，DHI對肝纖維化治療作用的體內藥效及機制尚不明確。本研究利用肝臟代謝組學方法研究肝纖維化密切相關的生物標志物，探索肝纖維化相關病理過程，同時采用DHI進行干預，研究其對肝纖維化的治療作用及作用機制，為肝纖維化早期診斷、有效治療提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

METTLER AE240 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；FRESCO17臺式冷凍離心機 (Thermo Fisher，美國)；DZG-6020真空干燥箱 (上海益恒實驗儀器公司)；Agilent 1290 Infinity 液相色譜儀、Agilent 6538 Q-TOF/MS 質譜儀、Micro17高速離心機（Thermo Fisher Scientific，美國）；HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，2.5μm）(Waters，美國)。

1.2 試藥

DHI（純度 98%，上海一飛生物科技有限公司）；硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA，東京化成工業株式會社)；甲醇、乙腈（均為色譜純，德國Merck公司），甲酸（色譜純，ROE scientific INC，美國）；水為實驗室制備的超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

SD大鼠，雄性，質量(200～250 g)，共28只，購自中國科學院上海實驗動物中心，合格證號：SCXK(滬)2012-0002。飼養于海軍軍醫大學實驗動物中心，遵循動物實驗的標準操作規范。飼養條件：溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%，12 h晝夜交替循環的條件下籠養。

2 方法

2.1 動物模型的構建和治療

將28只雄性SD大鼠隨機分為4組：正常組、肝纖維化模型組、DHI低劑量組和DHI高劑量組，每組7只。24 h適應性飼養后，除正常組外，模型組及不同用藥劑量干預組每周3次腹腔注射200 mg/kg TAA，持續給TAA造模8周；同時，自第5周起，按照給藥劑量持續給藥4周：正常組、模型組，每日給予生理鹽水10 ml/kg；DHI低劑量組，每日給予DHI15 mg/kg；DHI高劑量組，每日給予30 mg/kg。

2.2 樣品收集

最后一次給藥24 h后，采用脊椎脫臼法處死大鼠。快速切除肝臟后，用0 ℃生理鹽水沖洗并立即放于液氮中快速冷凍，儲存于-80 ℃冰箱直至分析。

2.3 樣品制備

將凍存的肝臟組織置于室溫自然解凍，取約100 mg肝臟樣本于勻漿管中，加入800μl甲醇，在60 Hz下充分勻漿至沒有纖維顆粒，4 ℃離心15 min（14 500×g）后取上清液置于1.5 ml的離心管中，氮氣吹干。在上述氮氣吹干的樣品殘渣中加入300 μl含內標甲醇渦旋30 s（內標為L-2-氯苯丙氨酸，濃度為5 μg/ml），每個樣品取10μl混勻作為質量控制樣品。

2.4 LC-MS分析

色譜條件：Agilent 1 290 Infinity UHPLC，色譜柱：Waters XSelect HSS T3 column色譜柱，柱溫：30 ℃；進樣量：3 μl；流動相A：含0.1 %甲酸的水，流動相B：含0.1 %甲酸的乙腈。流速：0.4 ml/min；梯度洗脫條件：0～2 min，2 %B，2～17 min，2 %～98 % B，17～19 min，98 %B。質譜條件：Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF/MS，離子源：電噴霧（ESI）離子源，正、負離子檢測模式；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣體流量：11 L/min；碎裂電壓：120 V；毛細管電壓：4 000 V（ESI+）/3 500 V（ESI-）；質譜掃描范圍：50～1 500m/z。

2.5 數據分析

2.5.1 數據處理

將采集的質譜數據轉換為mzData格式文件，然后通過R軟件XCMS程序將質譜數據轉化為含有保留時間、質核比、峰強度的數據矩陣。保留頻數超過80%的質核比數據，并對所有峰面積以內標峰面積和肝組織質量進行歸一化處理。

2.5.2 差異代謝物篩選

將上述獲得的二維矩陣列表導入SIMCA 14.1軟件中進行多元統計分析，采用正交偏最小二乘判別分析研究各組間差異，并得到變量VIP值。正常組和模型組組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用VIP＞1，且選擇差異具有顯著性（P＜0.05）的變量作為潛在的差異代謝物，然后檢索數據庫（HMDB、METLIN、KEGG數據庫），篩選出潛在的差異代謝物。

2.5.3 統計學分析

使用SPSS 21.0統計軟件進行數據統計分析，組間數據采用單因素方差分析（ANOVA），兩組樣本分析采用獨立樣本t檢驗，分析數據差異的統計學意義，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 基于LC-MS的肝組織代謝輪廓分析

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS在正、負兩種模式下對肝組織進行代謝組學分析，兩種模式下典型的總離子流圖見圖1。代謝組學數據的穩定性、重現性對研究的可靠性非常重要，為考察實驗的系統穩定性，本研究從每個肝組織樣品中取10 μl混勻后作為質量控制樣品。在樣品序列一開始連續進樣10針QC樣品，并按每7個樣品再進樣一針，共進樣14次。正、負離子模式下，QC樣品均顯示良好的聚集狀況，證明該分析系統穩定可靠。

圖1 肝臟正負離子模式下典型的LC-MS總離子流圖

3.2 多變量統計分析

經過數據處理后，LC-MS數據集在正離子模式下得到368個離子，在負離子模式下得到249個離子。根據OPLS-DA方法對數據進行分析，OPLSDA是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，最大特點是可以去除自變量和分類變量無關的分類變異，根據得分圖可以揭示數據離散程度，發現異常值[7]。在得分圖上具有相似的代謝物組成的樣本，處在比較相似的位置，樣本間距越遠代表代謝物差異越大，樣本間生理狀態相差越大。將正常組、模型組、DHI低劑量組和DHI高劑量組的LCMS數據導入到SIMCA進行分析，其得分如圖2A、2B所示，正常組與模型組樣本各自聚為一類，并且完全分離，說明肝纖維化大鼠模型的肝組織代謝輪廓發生顯著改變，代謝物的種類或水平發生了明顯變化。DHI給藥組（DHI低劑量組、DHI高劑量組）能夠與模型組明顯區分，并向正常組靠近，表明DHI給藥組可恢復部分代謝物至正常水平。

圖2 基于LC-MS正負離子模式下的OPLS-DA分析得分圖

3.3 差異代謝物的篩選

OPLS-DA可用于尋找導致聚類間顯著差異的變量，篩選正常組和肝纖維化大鼠模型組間潛在的差異代謝物。基于OPLS-DA模式下VIP＞1篩選兩組間的差異代謝物，進行t檢驗后，篩出模型組和正常組間差異具有顯著性的變量（P＜0.05）。基于VIP和t檢驗以及HMDB和KEGG等數據庫比對，篩選出38個與TAA誘導肝纖維化大鼠模型相關的較為重要的差異代謝物作為潛在生物標志物（表1）。通過KEGG、HMDB等數據庫查詢，我們發現這些代謝物主要涉及谷胱甘肽代謝、褪黑素代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、三羧酸循環等途徑。

表1 TAA誘導肝纖維化相關的差異代謝物及其代謝通路

3.4 DHI的干預治療

以肝纖維化相關的差異代謝物的相對含量作為檢測指標可以評價DHI對肝纖維化的治療作用，比較發現33種代謝物的含量發生明顯逆轉（圖3），同時，有14種代謝物的含量回調與DHI的劑量成正相關性，即高劑量組比低劑量組回調更多（圖3A、3B）。

圖3 33種潛在標志物在正常組、肝纖維化模型組、DHI給藥組中的相對含量變化

4 討論

4.1 研究意義

肝纖維化是一種發病機制復雜，可導致肝硬化、肝衰竭甚至肝癌等嚴重肝臟疾病的慢性流行肝病，然而目前并沒有藥物可以治療肝纖維化，中藥及其活性成分由于其多靶點、多通路等特點被認為是肝纖維化治療的潛在藥物。代謝組學可以對生物體內小分子代謝產物進行動態分析，通過分析闡述代謝物與生理病理變化間的聯系，對肝纖維化的機制進一步闡述，也能通過肝纖維化相關差異代謝物的含量相對變化分析藥物對肝纖維化模型的藥效作用。本研究用肝臟代謝組學方法分析了與TAA誘導的肝纖維化模型密切相關的38種代謝物，主要涉及谷胱甘肽代謝、褪黑素代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、三羧酸循環等途徑，DHI能夠通過調節部分代謝通路發揮預防和治療肝纖維化作用。

4.2 谷胱甘肽代謝

肝纖維化的產生伴隨著肝細胞死亡和肝星狀細胞(HSCs)的活化，HSCs約占正常人肝臟中非實質細胞的1/3和總駐留細胞的15%，HSCs從靜態到激活會使得ECM過剩表達而導致纖維化，而氧化應激在HSCs激活和ECM形成中發揮重要的促進作用[1,8]。谷胱甘肽（GSH）是人體內含量最豐富的抗氧化劑，也是體內氧化防御體系的主要組成成分之一[9]。GSH可以在谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽-S-轉移酶以及谷胱甘肽還原酶的作用下與其氧化態相互轉換，清除部分有機過氧化物，調節體內的氧化還原穩態，緩解氧化應激對組織造成的損傷[10-11]。有研究表明，在對乙酰氨基酚、四氯化碳、重金屬砷等誘導下，大鼠肝組織中GSH含量下降[12]。本研究中，TAA誘導的肝纖維化大鼠模型肝組織中GSH顯著下降，這與谷胱甘肽在其他肝損模型中下調的趨勢一致。經過DHI干預后GSH回調，且高劑量DHI比低劑量組回調比例更大，這說明DHI可能調整體內谷胱甘肽代謝通路，通過提高體內谷胱甘肽含量恢復肝組織抗氧化功能，緩解氧化應激對肝臟的進一步損傷，從而起到抗肝纖維化作用。

4.3 褪黑素代謝

肝纖維化過程中，抑制HSC的激活和增殖是預防和治療肝纖維的重要途徑。血小板衍生生長因子(PDGF)可以激活JAK2/STAT3信號通路，致使HSC增殖，并抑制HSC凋亡[13]。已有研究證明，褪黑素通過抑制JAK2/STAT3相關信號通路或抗氧化機制來抑制HSC的激活和增殖從而發揮肝臟保護作用[14-15]。在本研究中，環6-羥基褪黑素及N-乙酰血清素硫酸鹽均為褪黑素代謝產物，在模型組中含量顯著增加，說明褪黑素被大量代謝，肝臟保護作用被抑制。經過DHI的干預后兩種褪黑素代謝產物均回調，這提示DHI可能通過調整褪黑素代謝，回調褪黑素及其代謝產物的機體內含量發揮抗肝纖維化活性。

4.4 氨基酸代謝

肝臟是機體物質代謝的中樞器官，在氨基酸的新陳代謝和蛋白質的合成與分解中發揮重要作用。天冬氨酸是一種酸性氨基酸。天冬氨酸在哺乳動物中一般被認為是一種營養上非必需的氨基酸。然而，越來越多的文獻表明，天冬氨酸在包括肝臟生理學在內的許多生物和生理過程中起著重要作用，如合成精氨酸以維持巨噬細胞應對免疫挑戰，同時，也有證據表明天冬氨酸可以減輕肝損傷、增強肝臟功能[16]。本研究發現TAA誘導大鼠肝纖維化后，與正常組比較，模型組中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路被干擾，L-天冬氨酸含量顯著變化，經過DHI的干預后回調，這提示DHI可能調整丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路，改變體內天冬氨酸含量發揮肝保護作用。

4.5 脂質代謝

脂質不僅是細胞膜的組成成分，而且參與信號轉導。磷脂酰膽堿、鞘脂、溶血性磷脂酰膽堿是血清脂蛋白和細胞膜的重要組成成分。溶血磷脂酰乙醇胺是磷脂酶A1水解磷脂酰乙醇胺(PE)失去一分子脂肪酸生成的產物，作為一種溶血卵磷脂，在肝臟中與卵磷脂一起在線粒體間進行轉移[17]。有研究證明，PE通過N-甲基轉移酶生成PC的通路約占PC產生量的30%，磷脂酰膽堿為肝臟重要營養來源，可以拮抗肝臟受病毒、藥物、酒精及其他有毒物質的侵害，防止肝纖維化[9]。肝臟是脂質生成和脂肪酸氧化等脂類代謝的主要場所，肝纖維化時可以引起脂質合成、轉運及分解代謝的普遍紊亂，而脂質代謝異常又會加重肝損害，引起肝臟的脂毒性[18]。在本研究中，4種LysoPE在模型組中均發生下降，另外一些磷脂代謝相關物質，如GlcCer(d18:1/12:0)、PE(16:0/P-16:0)、PE(18:0/15:0)、CL(i-13:0/i-22:0/i-12:0/i-13:0)和脂質代謝相關物質如二酰甘油（DG）、甘油磷酸甘油、牛磺酸熊去氧膽酸等在正常組與模型組大鼠中也存在顯著差異，說明TAA誘導的大鼠肝纖維化模型脂質代謝的紊亂。經過DHI干預治療后，代謝物水平不同程度得到回調，表明DHI可通過干預多個脂質代謝通路發揮其抗肝纖維化活性。

4.6 能量代謝

三羧酸循環是糖、脂肪、氨基酸三大營養素的最終代謝通路，在能量代謝、提供生物合成的前體中起重要作用。琥珀酸既是三羧酸循環的的重要中間產物，也是一種重要的細胞外信號分子，在信號傳遞、炎癥反應、肝纖維化的發生發展中發揮著重要作用[19]。在本研究中，肝纖維化模型組大鼠琥珀酸的代謝變化趨勢均與正常大鼠相反，而給予DHI后趨近正常，說明DHI能夠改善肝纖維化大鼠的能量代謝。

5 結論

本研究建立了LC-MS代謝組學分析的方法，通過OPLS-DA篩選出與肝纖維化密切相關的38種差異代謝產物，主要涉及谷胱甘肽代謝、褪黑素代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、三羧酸循環等途徑。基于38種差異代謝物在正常組、模型組及DHI給藥組之間相對含量的差異，對DHI預防治療大鼠肝纖維化模型的藥效進行了評價，結果表明DHI能夠回調34種潛在差異代謝物的相對含量，調節部分失衡代謝通路，發揮抗肝纖維化作用。本研究為肝纖維化的新標志物和治療靶點的發現以及DHI作為抗肝纖維化潛在藥物的進一步開發應用提供實驗依據。