馬尾松葉低極性部位的GC-MS分析及協同氟康唑抗耐藥白念珠菌活性研究

孔飛飛，鄭 巍，郭良君，金永生 （. 陸軍第七十二集團軍醫院藥劑科，浙江 湖州 33000；. 海軍軍醫大學藥學院有機化學教研室，上海 00433）

松科(Pinaceae)植物馬尾松(PinusmassonianaLamb.)主要產于江蘇、安徽、河南、陜西及長江中下游各省區，資源豐富[1]。松葉“味苦，溫；暖，無毒”，具有祛風燥濕、殺蟲、止癢之功用。水煎、浸酒以外用或內服[2]用于治風濕痿痹、跌打損傷、濕瘡、疥癬、慢性氣管炎等癥以及預防感冒、流腦。文獻報道馬尾松葉中的主要化學成分為揮發油、黃酮、多糖、木脂素和樹脂等，現代藥理研究表明馬尾松葉提取物具有抗氧化、抗衰老、抑菌等多方面活性[3-15]。

近年來由于抗生素的濫用、器官移植、免疫抑制劑以及HIV患者的增多，深部真菌感染發病率逐年上升，其中白念珠菌是最主要的致病菌。氮唑類藥物氟康唑是臨床上首選的抗白念珠菌(Candida albicans)感染藥物。但是長期和重復給藥導致白念珠菌對氟康唑耐藥越來越強。目前聯合用藥是恢復耐藥真菌對治療藥物的敏感度，提高耐藥菌對氟康唑的敏感性，治療深部耐藥菌感染的一種有效的治療途徑。從天然活性成分中尋找與現有的抗真菌藥物聯合發揮協同作用的小分子化合物是近年來的研究方向之一[16-20]。本文選用接近“傳統水煎或浸酒法”的傳統中藥提取方法，用乙醇加熱提取后，石油醚再萃取的方法得到馬尾松葉低極性部位，通過測定馬尾松葉低極性部位協同氟康唑抗耐藥白念珠菌的MIC80值，同時，采用氣相色譜-質譜的方法對低極性部位的化學成分進行分析鑒定，初步探究其聯合氟康唑的體外抗真菌活性。

1 材料

1.1 試劑與設備

Thermo Trace GC Ultra氣相色譜、Thermo DSQ Ⅱ質譜、Xcalibur工作站(美國賽默飛世爾公司）；馬尾松葉(浙江東陽市，經海軍軍醫大學黃寶康教授鑒定為馬尾松PinusmassonianaLamb.)；所有試劑均為分析純；水為重蒸水；載氣為高純氦氣。

氟康唑注射液（上海信誼金朱藥業有限公司）；黃芩素（上海歷鼎生物技術有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，中國醫藥集團上海化學試劑公司）；白念珠菌103（Candida albicans103，海軍軍醫大學長海醫院真菌室提供）。

1.2 馬尾松葉低極性部位的制備

取干燥馬尾松葉，粉碎，稱取二份，每份50.0 g，分別用150 ml石油醚和80%乙醇加熱回流提取1h，濾過；濾渣再分別用150 ml石油醚和80%乙醇加熱回流提取1 h，濾過。分別合并兩次濾液，濾液用旋轉蒸發儀減壓濃縮，回收溶劑，得石油醚提取物（簡稱醚提取物）2.5 g和80%乙醇提取物（簡稱醇提取物）8.0 g。取干燥后的醇提取物5.0 g，加入水100 ml混溶，獲得混懸液。混懸液用50 ml石油醚萃取3次，合并濃縮石油醚萃取液，獲得石油醚浸膏（簡稱醚浸膏）即馬尾松葉低極性部位0.8 g。取125 mg醚浸膏，置于100 ml量瓶中，加入80%甲醇，超聲、加熱使其幾近完全溶解，放置、冷卻；再加入80%甲醇定容，搖勻、放置；吸取1 ml定容后的浸膏液，微孔濾膜過濾后待測。

1.3 色譜-質譜條件

色譜柱TR - 35MS石英毛細管（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升溫，起始溫度40 ℃，保持2 min后以10 ℃/min的速度升至300 ℃并保持5 min；汽化溫度250 ℃，進樣量1 μl；分流比10∶1。載氣為高純氦氣，流速1.0 ml/min。離子源：EI源；離子源溫度為250 ℃；電子能量：70 eV；掃描范圍：50～650m/z。

2 方法

2.1 抑菌實驗方法

菌株選用臨床分離耐藥菌株白念珠菌103（氟康唑的MIC80＞128.0 μg/ml）。采用美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）提出的RPMI1640 培養基微量稀釋法，取無菌96孔板，于每排1號孔加RPMI1640液體培養基100 μl作空白對照；3～12號孔各加新鮮配制的菌液100 μl，菌液濃度范圍為（1～5）×103cfu/ml；2號孔分別加菌液160 μl和受試藥物溶液40 μl；12號孔不含藥物，只加菌液100 μl作陽性生長對照。2～11號孔進行倍比稀釋，使各孔的最終藥物（醚提取物、醇提取物和醚浸膏）濃度分別為250.0、125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98和0.49 μg/ml，對照品黃芩素濃度分別為128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1%，氟康唑溶液的終濃度為8.0 μg/ml。96孔板于30℃恒溫培養箱培養24 h后取出，讀取受試藥物與氟康唑（8.0 μg/ml）聯用時的MIC80值。微量稀釋法測試結果見表1。

表1 馬尾松葉3種提取物與氟康唑聯用對體外白念珠菌103活性(MIC80)試驗結果

協同藥效的判定采用聯合抑菌濃度分數指數（FICI），即聯用抑菌時每種藥物所需最低抑菌濃度（MIC）與單用這種藥物抑菌時所需MIC的比值的和。當FICI≤0.5時，兩種藥物的相互作用效果被定義為具有協同作用；當FICI＞0.5時，認為兩種藥物無相互作用。

2.2 色譜-質譜分析方法

按“1.3”項下實驗條件對馬尾松葉低極性部位進行分析，25 min得到馬尾松葉低極性化學成分的總離子流圖（圖1）。共檢測出30個峰，通過檢索NIST08光譜數據庫，按60%以上匹配率（SI和RSI均大于600，最大值1 000），并結合質譜裂解規律確定其化學成分。運用峰面積歸一法通過Xcalibur化學工作站數據處理系統，測得各個化學成分在石油醚部位中的質量百分數。

圖1 馬尾松葉低極性化學成分總離子流圖

3 結果與分析

由表1可見，各受試藥物單用時，對照品黃芩素的MIC80為16.0 μg/ml，提示了其具有一定的抗菌活性，其他的化合物的MIC80均大于250 μg/ml。各受試藥物與氟康唑（8.0 μg/ml）聯用后，對照品黃芩素、醇提取物及醚浸膏的MIC80降至4.0～31.25 μg/ml，相應的FICI值均小于0.5，顯示黃芩素、醇提取物、醚浸膏分別與氟康唑聯用對耐藥白念珠菌均具有協同活性，但醇提取物和醚浸膏的協同活性不及對照品黃芩素，醚浸膏協同活性小于醇提取物。醚提取物單用及與氟康唑聯用的MIC80均大于250 μg/ml，FICI大于0.5，顯示其單用及與氟康唑聯用均沒有協同氟康唑抗耐藥白念珠菌活性。

如表2所示，本次GC-MS檢測出30種成分，鑒定出17個化合物。統計出本次所測馬尾松葉的低極性化學成分中含有烷烴4個（6.1%），甾烷類5個（4%），脂肪酸1個（0.75%），二萜5個（53.99%），其他峰均提示為聚硅氧烷（35.16%），其中含量較高的化學成分是：瑪瑙酸（8.38%，見圖2）、脫氫樅酸甲酯（8.41%，見圖3）。

圖 2 瑪瑙酸/貝殼杉萘甲酸

圖3 脫氫樅酸甲酯

表2 馬尾松葉低極性化學成分分析結果

4 討論

近年來研究發現馬尾松葉提取物具有抗真菌活性：馬尾松葉石油醚、氯仿等溶劑的提取物以及不同比例的乙醇水提取物可以抑制曲霉、青霉、啤酒酵母的生長；馬尾松葉乙醇提取物對枯萎病、灰霉菌有顯著的抑菌活性；馬尾松葉水提物對白色念珠菌有較弱抑菌性[21-25]。但馬尾松葉提取物對氟康唑耐藥白念珠菌的協同抗菌活性未見報道。

本研究發現，馬尾松葉的醇提取物和醚浸膏單獨使用時均不及黃芩素，沒有抗耐藥白念珠菌活性，但聯用氟康唑（8 μg/ml）后，醇提取物和醚浸膏均表現出協同活性，醇提取物的活性更好，而醚提取物無論是單獨使用還是聯用氟康唑都沒有抗耐藥白念珠菌活性。醚浸膏與醚提取物相比，提取方法的改變，導致了提取物抑菌效果的有無。醚浸膏的活性應該源于乙醇加熱提取獲得的更豐富、含量更高的化學成分，盡管醚浸膏的主要成分也是低極性成分，但與醚提取物相比無論在含量和組成上均應不同。醚提取物含有更豐富的揮發油等低極性成分，但是可能缺少了一些重要的活性抗真菌成分，導致其沒有協同抗耐藥真菌作用。我們進一步對活性部位醚浸膏進行了GC-MS化學成分分析，結果表明，其化學成分與文獻報道的采用水蒸氣和超臨界CO2提取法獲得的馬尾松葉揮發油成分相比差異大。活性部位醚浸膏中化合物結構類型和數量比文獻報道的直接提取的揮發油少，且沒有以蒎烯、莰烯為主的單萜和以石竹烯等為主的倍半萜，僅有烷烴類少量化合物重合[26-31]。活性部位醚浸膏采用了乙醇加熱提取后，再經石油醚萃取得到，加熱提取可能導致了蒎烯、莰烯、石竹烯等低沸點萜類化合物的丟失，但分子量更大的二萜類化學成分含量升高（53.99%）。二萜類化學成分中脫氫樅酸甲酯、海松酸甲酯是主要化學成分，兩者也是松香酸的主要成分。有文獻報道松香酸具有抗赤霉菌、灰霉菌等多種抗真菌活性[32-35]。因此，醚浸膏中的二萜類化合物可能是其協同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用的重要活性成分，值得進一步研究。此外，Zuzana研究發現云杉提取物中的β-谷甾醇抑制微生物生長，同時低濃度的脫氫樅酸甲酯破壞細胞壁，兩者相互協同可能是云杉提取物對青霉菌、鏈格孢菌、米根霉的抑菌活性的關鍵[36]。本研究獲得的醚浸膏中也含有豐富的樹脂酸（13.03%）和甾烷（4%）。樹脂酸和甾烷的協同可能也是醚浸膏具有協同氟康唑抗耐藥白念珠菌活性的原因，這一點也值得進一步研究。

綜上所述，本文首次報道了馬尾松葉乙醇提取物以及馬尾松葉低極性部位具有協同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用，并首次對馬尾松葉低極性部位進行了GC-MS分析，鑒別的化合物除了烷烴、脂肪酸、脫氫樅酸甲酯外其它11種成分都是首次從該植物中發現，豐富了馬尾松葉的化學成分。