紫檀芪通過PI3K/Akt通路對膿毒癥大鼠膈肌的保護作用

曾海平，吳東方，胡云雙

1.溫州市中西醫結合醫院 檢驗科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035

膿毒癥是由嚴重感染引起的以多器官功能障礙為主要特征的臨床綜合征，常伴有急性呼吸衰竭，其中呼吸肌無力是重要因素。膈肌作為主要的呼吸肌，膈肌功能障礙可嚴重損害呼吸泵，進而導致患者長期依賴呼吸機、ICU住院時間延長、呼吸衰竭甚至死亡[1]。目前膿毒癥的病理生理機制尚未完全闡明，在膿毒癥早期觸發的炎癥反應中釋放大量促炎細胞因子，如TNF-α、IL和PG等，在膿毒癥誘導的膈肌功能障礙中起著重要作用[2]。紫檀芪（pterostilbene,PTS）是一種與白藜蘆醇結構類似的抗毒性物質，主要存在于藍莓、葡萄和花生等植物中。近年來有研究表明，PTS具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗衰老和抗病毒活性等[3]。此外，PTS還能介導細胞周期、凋亡和增殖[4]。然而，PTS在膿毒癥中的作用，尤其是在膿毒癥導致膈肌功能障礙中的作用鮮見報道。本研究擬探討PTS在膿毒癥致大鼠膈肌損傷中的作用，并探討其可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料 6～8周齡健康雄性Wistar大鼠，體質量180～250 g，購自中國科學院上海實驗動物中心，動物在無病原體的條件下飼養于溫州醫科大學實驗動物中心，大鼠可以自由獲取食物和水，并在室溫和50%～65%相對濕度下保持12 h的光/暗循環。PTS（純度99%）購自上海義森生物科技有限公司；AChE測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-1β、TNF-α、IL-6、MPO測定試劑盒（ELISA）購自美國Pierce公司；AST、LDH、CK測定試劑盒購自美國Abcam公司；凋亡檢測試劑盒（C1088）購自上海碧云天生物技術有限公司；ProteoPrep總蛋白提取試劑盒購自美國Sigma公司；t-Akt、p-Akt、t-PI3K、p-PI3K和β-actin抗體購自美國Epitomics公司。

1.2 膿毒癥模型及分組 大鼠按隨機數字表法分成3組（每組10只）：假手術組、膿毒癥組和PTS組。膿毒癥組和PTS組大鼠均行盲腸結扎穿刺術誘導盲腸壞死膿毒癥模型[5]。大鼠禁食12 h后腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）用于手術前麻醉，常規消毒后沿腹中線做2 cm切口，在盲腸總長度一半的距離處，用18號注射針頭在腸系膜緣和系膜對側緣方向各穿孔1次，然后輕輕按壓盲腸，腸內容物被輕輕壓入腹腔，恢復盲腸正常解剖部位，逐層縫合切口，立即皮下注射無菌0.9%氯化鈉溶液（3 mL/100 g）以補償體液流失。假手術組大鼠進腹定位盲腸后，不穿孔盲腸。

手術前30 min，PTS組大鼠接受PTS腹腔注射（25 mg/kg）1次，假手術組和膿毒癥組大鼠腹腔注射等量的無菌0.9%氯化鈉溶液，24 h后通過腹腔注射戊巴比妥對所有存活大鼠實施安樂死，隨后從左側膈肌中部采集5 mm寬膈肌，立即測量膈肌收縮力，進行下一步檢測。

1.3 膈肌收縮性能測定 將膈肌條垂直懸掛在 37 ℃的Krebs組織液中，將2 個銀電極平行放置在肌條上，并連接到電刺激器（ALC-MPA2000-S，Alcott Biotech）。經過15 min的熱平衡期后，確定肌條產生最大收縮力的最佳長度（L0），然后將刺激強度設置為電壓強度的120%，當L0達到最大收縮反應時調整電壓強度，以確保閾上刺激。分別使用10、20、40、60、80和120 Hz頻率電刺激膈肌條。疲勞指數（fatigue index,FI）：給予肌條刺激頻率40 Hz，刺激電壓15 V，刺激時間330 ms，串間隔670 ms的刺激，共計300串刺激，計算第120個肌顫搐與第1個肌顫搐的比值，即FI。

1.4 組織病理學觀察及膈肌損傷評分（diaphragm damage score，DDS）采集的膈肌組織用4%中性甲醛固定，對每個組織樣本進行石蠟包埋，5 μm切片后使用蘇木精/伊紅染色，乙醇梯度脫水封閉后進行組織病理學觀察。膈肌損傷的嚴重程度根據半定量量表進行評估和分級，包括水腫、中性粒細胞浸潤、出血和肌原纖維分布[6]。由兩位對分組情況不知情的病理學專家進行描述，嚴重程度表示為DDS。

1.5 TUNEL法檢測膈肌細胞凋亡 根據凋亡檢測試劑盒的說明書對組織切片進行TUNEL染色。用熒光顯微鏡觀察TUNEL陽性細胞，凋亡細胞呈黃綠色熒光，正常細胞無熒光，在200倍下隨機選擇5個視野計數凋亡細胞，取平均數。

1.6 ELISA法檢測大鼠膈肌組織中AChE、IL-1β、TNF-α、IL-6、AST、LDH、CK以及MPO活性 將膈肌組織進行勻漿后，按照相應ELISA檢測試劑盒的操作說明分別檢測膈肌組織中AChE、IL-1β、TNF-α、IL-6、AST、LDH、CK以及MPO活性。

1.7 Western blot檢測膈肌組織中蛋白表達 從膈肌組織中分離出總蛋白，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質樣品轉移到聚偏氟乙烯膜上。在室溫下用Western封閉劑（Beyotime）封閉2 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜以進行免疫印跡，用TBST沖洗3次后，在室溫下用過氧化物酶結合的二抗室溫培養1 h，采用電化學發光溶液進行圖像顯影，使用Quantity One 4.6.2（BIO-RAD）軟件分析圖像。

1.8 統計學處理方法 采用SPSS19.0軟件包進行統計分析。數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 假手術組大鼠全部存活，膿毒癥組有6只、PTS組有8只存活至術后24 h。此外，進行手術的存活大鼠均出現不同程度的膿毒癥癥狀，如活動障礙、毛發豎立、呼吸短促、結膜下滲出和腹瀉等。

2.2 膈肌收縮力-頻率關系 膿毒癥組膈肌條在所有刺激頻率（10～120 Hz）下的收縮力均明顯低于假手術組和PTS組（P＜0.05），PTS治療可部分恢復膿毒癥時膈肌收縮力的下降（P＜0.05），見圖1。假手術組、膿毒癥組和PTS組的FI分別為84.5±6.8、80.3±7.5和79.6±7.8，3組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 膈肌條收縮力-電刺激頻率曲線

2.3 膈肌組織病理學觀察及DDS半定量分析 3組大鼠膈肌組織病理學檢測結果顯示，假手術組大鼠膈肌組織經HE染色后肌肉組織呈多邊形粉紅色纖維，肌肉纖維排列整齊緊湊，少有炎性細胞浸潤。術后24 h，膿毒癥組大鼠膈肌組織在鏡下出現明顯改變，肌肉組織排列紊亂，伴有大量炎性細胞浸潤，細胞間隙增寬。PTS治療可部分改善CLP后導致的病理改變，肌肉纖維排列相對規律，細胞間水腫和出血減輕，炎性細胞浸潤明顯減少。半定量分析各組DDS結果表明，膿毒癥組DDS評分高于假手術組，而PTS治療后DDS評分顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠膈肌組織病理學表現（×200）及DDS評分

2.4 PTS對膈肌細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示，與假手術組相比，膿毒癥組TUNEL陽性肌肉細胞明顯增多（P＜0.05），而與膿毒癥組相比，PTS組TUNEL陽性細胞顯著減少（P＜0.05），見圖3。

圖3 TUNEL染色法測定各組大鼠膈肌細胞凋亡

2.5 PTS對膈肌組織中AChE活性的影響 與假手術組相比，膿毒癥組AChE活性明顯降低（P＜0.05），而與膿毒癥組相比，PTS組AChE活性顯著升高（P＜0.05），見圖4A。

2.6 PTS對膈肌組織中促炎細胞因子的影響 與假手術組大鼠相比，膿毒癥組大鼠CLP術后24 h膈肌組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著升高（P＜ 0.05），而PTS治療后膈肌組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均明顯降低（P＜0.05），見圖4B、4C、4D。

2.7 PTS對膈肌組織中肌肉損傷生物標志物的影響 由于骨骼肌損傷沒有特異的生物標志物，本研究通過檢測膈肌組織中AST、LDH、CK以及MPO活性來評估肌肉損傷。如圖4E、4F、4G、4H所示，大鼠膈肌組織中AST、LDH、CK以及MPO活性在術后24 h均顯著升高（P＜0.05），而PTS治療后上述生物標志物水平顯著下降（P＜0.05）。與假手術組比：aP＜0.05；與PTS組比：bP＜0.05

圖4 ELISA法測定各組大鼠膈肌組織AChE活性、IL-1β、TNF-α、IL-6、AST、LDH、CK及MPO含量

2.8 PTS對膈肌組織中PI3K-Akt信號通路的影響 Western blot檢測結果顯示，大鼠膈肌組織中p-PI3K和p-Akt的蛋白表達量在CLP術后均明顯降低（P＜0.05），而p-PI3K和p-Akt的蛋白表達量在PTS治療后均顯著增加（P＜0.05），見圖5。

圖5 Western blot檢測各組大鼠膈肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達

3 討論

膿毒癥作為一種常見且難以治療的危重病，導致沉重的社會和經濟負擔。本研究通過建立大鼠膿毒癥模型，觀察PTS對膿毒癥大鼠膈肌功能的影響，結果表明PTS可增強膈肌收縮力和AChE活性、減輕炎癥反應以及抑制膈肌細胞凋亡，從而對膈肌發揮保護作用，機制研究表明PTS可能通過激活PI3K/Akt信號通路從而抑制肌肉損傷和炎癥反應，本研究為治療膿毒癥提供一種新的治療選擇。

CLP作為當前公認的大鼠膿毒癥的金標準模型制作方法[7]，膿毒癥導致膈肌功能障礙是一個非常復雜的病理過程，包括炎癥、氧化應激、代謝失衡、線粒體功能障礙、肌肉細胞凋亡等，其中炎癥和氧化應激是膿毒癥時膈肌功能障礙的兩個主要因 素[8]。本研究通過CLP建立大鼠膿毒癥模型，CLP術后24 h，大鼠膈肌組織中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細胞因子水平升高，死亡率升高，同時存活大鼠出現膿毒癥綜合征，表明成功建立大鼠膿毒癥模型，與既往研究相仿[9]。既往研究表明，諸如TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細胞因子對膿毒癥的進展有促進作用，促炎細胞因子還可導致膈肌功能障礙和AChE活性下調[10]。當前對PTS的抗炎作用已有較為深入的研究[3]，但PTS是否通過抗炎作用從而保護膿毒癥大鼠膈肌功能尚未見報道。在本研究中，PTS可降低膈肌組織中促炎細胞因子的表達，同時在顯微鏡下觀察到PTS可明顯抑制炎性細胞在肌肉組織中浸潤。此外，神經肌肉連接處的AChE活性是膈肌的另一重要特性，患者在全身麻醉后，通常需要肌肉松弛拮抗劑抑制AChE活性發揮治療作用，從而加速肌肉功能的恢復[11]。因此，抑制膿毒癥期間炎癥和氧化應激理論上有助于維持膈肌收縮功能和AChE活性。在本研究中，PTS治療后，膈肌收縮力明顯提高，同時膿毒癥期間膈肌的AChE活性也得到改善。

本研究還進一步檢測了膈肌組織中AST、LDH和CK活性，以間接觀察骨骼肌損傷，研究結果表明膿毒癥引起膈肌嚴重氧化損傷，與既往研究結果相 仿[12]。有趣的是，PTS治療顯著降低了膿毒癥期間膈肌組織中AST、LDH和CK活性，說明膿毒癥引起的膈肌氧化損傷在PTS作用后得到了一定程度的緩解，上述結果符合其對心肌和神經元氧化應激的保護作用[13-14]。MPO是由中性粒細胞合成和分泌的一種酶，MPO可以將H2O2轉化為HOCl，HOCl是一種比H2O2更為活躍的活性氧，從而在組織炎癥反應和中性粒細胞浸潤中發揮關鍵作用[16]。本研究發現PTS組大鼠膈肌的MPO活性與膿毒癥組相比顯著降低。同時，膿毒癥大鼠膈肌中可見大量中性粒細胞浸潤、細胞核增大、骨骼肌纖維間距增大，PTS治療后，中性粒細胞浸潤、細胞核大小、骨骼肌纖維間距和DDS評分均明顯減小，這與MPO活性的變化相一致。以上發現提示膿毒癥過程中氧化應激和炎癥反應的相互作用關系。

PI3K/Akt通路是一條重要的信號轉導通路，Akt是PI3K的下游受體，在細胞增殖、分化、凋亡、遷移和轉錄等多種細胞過程中發揮重要作用[16]。Akt活性下調與細胞炎癥反應關系密切，而Akt激活可降低細胞氧化應激并抑制促炎癥細胞因子的釋放[17]。既往研究證實，PTS可以激活PI3K/Akt信號通路，并在缺血再灌注大鼠腦損傷中發揮保護作 用[18]。本研究表明，PTS改善了膿毒癥對大鼠膈肌中PI3K和Akt的抑制作用，從而為證實PTS能激活膿毒癥大鼠膈肌PI3K/Akt通路提供了理論依據。

綜上所述，本研究發現PTS可保護膿毒癥大鼠的膈肌功能和AChE活性，改善膿毒癥大鼠膈肌的炎癥浸潤、氧化損傷和細胞凋亡。此外，本研究表明PI3K/Akt通路是PTS在膿毒癥期間保護膈肌免受炎癥和氧化應激損傷的重要途徑。