Eg5通過c-Myc/SP1/CDK1通路調(diào)節(jié)去勢抵抗性前列腺癌細胞的惡性增殖

胡俊彪，張春霆，夏建洪，姚勇，陸俊儀

金華市人民醫(yī)院，浙江 金華 321000，1.泌尿外科；2.藥劑科

前列腺癌是男性最常見的生殖系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率僅低于膀胱癌和腎癌，居男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位[1-2]。前列腺癌異質(zhì)性極高，分為惰性前列腺癌和侵襲性前列腺癌[3-4]。其中，惰性前列腺癌細胞長期局限于前列腺內(nèi)，進展緩慢，可采用保守治療[3]。而侵襲性前列腺癌由于容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，進展迅速，只能采用睪丸切除術(shù)配合雄激素剝奪治療（androgen deprivation treatment,ADT）[4-5]。然而，侵襲性前列腺癌在接受了手術(shù)去勢或者ADT之后，往往容易發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer,CRPC）[6]。去勢抵抗性的產(chǎn)生，導(dǎo)致CRPC成為病死率極高的難治前列腺癌[6]。了解前列腺癌發(fā)展為CRPC的機制，尋找潛在治療靶點，是突破CRPC治療瓶頸的有效手段。

紡錘體有絲分裂驅(qū)動蛋白（Kinesin-5,Eg5），在細胞有絲分裂早期對雙極紡錘體的形成和染色體單體的分離起著至關(guān)重要的作用，與包括胰腺癌、肝癌及前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。研究表明，Eg5是具有ATP酶活性的運動特性馬達分子，參與調(diào)節(jié)細胞周期、細胞凋亡、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及DNA損傷應(yīng)答等多種生物學(xué)功 能[7，10]。Eg5在惡性腫瘤細胞內(nèi)的過度表達會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的過度表達[11]。而c-Myc的過度表達被證明可導(dǎo)致前列腺癌細胞產(chǎn)生去勢抵抗性[12]。作為c-Myc的下游靶點，特異性蛋白1（specificity protein 1,SP1）的過表達被證明和腫瘤進展及預(yù)后不良密切相關(guān)[13]。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，SP1被證明與ATP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)DNA雙鏈損傷修復(fù)、細胞周期及腫瘤轉(zhuǎn)移[14-15]。Eg5及其下游靶點c-Myc及SP1的生物學(xué)功能表明，Eg5可能是治療CRPC的有效靶點。然而，Eg5調(diào)節(jié)前列腺癌細胞產(chǎn)生去勢抵抗性的機制卻鮮有研究。本研究擬通過沉默Eg5的表達或者用小分子抑制劑SB-743921抑制Eg5的活性來探究Eg5對CRPC細胞株DU145生長、凋亡、周期及遷移的調(diào)節(jié)作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人CRPC細胞株DU145、PC-3及LNCaP均購自上海生命科學(xué)院細胞資源中心。人前列腺癌細胞株DU145用含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 kU/L青霉素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。人前列腺癌細胞株P(guān)C-3和LNCaP用含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 kU/L青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器：Eg5單克隆抗體、c-Myc單克隆抗體、SP1單克隆抗體、CDK1單克隆抗體、E-cadherin單克隆抗體、Vimentin單克隆抗體、β-actin單克隆抗體、鼠二抗及兔二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。Cyclin B1 單克隆抗體、Cyclin A1單克隆抗體、CDC25B單克隆抗體及N-cadherin單克隆抗體均購自美國Abcam公司。MTT試劑盒、Annexin V-FITC和典化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司。MEM培養(yǎng)基、胰酶及結(jié)晶紫染色液均購自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司。RIPA細胞裂解緩沖液購自南京三翊生物科技有限公司。Eg5小分子抑制劑SB-743921購自美國MedChemExpress公司。RNAiso Plus購自日本Takara-Bio公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及q-PCR試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。慢病毒NC shRNA載體及Eg5 shRNA載體購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。Cytation 5酶標儀購自美國Biotek公司；MACSQuant流式細胞儀購自德國美天旎生物技術(shù)公司；EVOS XL Core倒置熒光顯微鏡購自美國Thermo Fisher公司；Gel DocTM凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；蛋白電泳儀系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建Eg5 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株：Eg5在DU145細胞內(nèi)的表達由慢病毒Eg5 shRNA載體干擾實現(xiàn)。慢病毒NC shRNA及Eg5 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)DU145細胞株按照說明書構(gòu)建，通過測定細胞內(nèi)Eg5 mRNA及蛋白水平來確定基因是否被沉默。

1.2.2 MTT實驗：實驗分為對照組、NC shRNA組、Eg5 shRNA組和SB-743921組。其中，NC shRNA組和Eg5 shRNA組是將NC shRNA和Eg5 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)DU145細胞以4×104/mL接種于96孔板分別培養(yǎng)24、48、72 h，隨后用MTT法測定各組細胞生長活力。SB-743921對3種前列腺癌細胞株的生長抑制作用同樣用MTT法測定。用0～24 nmol/L的SB-743921分別處理3種癌細胞72 h后，測定SB-743921對各細胞的IC50值。待確定IC50值后，設(shè)置SB-743921組，將對數(shù)生長期的人CRPC細胞株DU145、PC-3及LNCaP以4×104/mL鋪板至96孔板，待細胞貼壁后，分別用濃度為2.0、4.0、8.0 nmol/L的Eg5 抑制劑SB-743921分別處理細胞24、48、72 h，探索不同濃度SB-743921對細胞生長活力的影響。隨后，在每孔加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩30 s之后，用酶標儀測定570 nm處的吸光度值。細胞生長活力（%）=實驗組吸光度值/空白對照組吸光度值×100%。

1.2.3 單克隆形成實驗：NC shRNA組和Eg5 shRNA組是將NC shRNA及Eg5 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)DU145細胞以500個/孔接種在24孔板，用含有8%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞14 d。SB-743921組是將處于對數(shù)生長期的DU145細胞以500個/孔接種在24孔板，待細胞貼壁之后，用SB-743921處理細胞14 d，由于實驗細胞密度低，處理時間長，SB-743921的濃度選用2.0 nmol/L。各組細胞每3 d換一次液，待培養(yǎng)細胞14 d后，移除培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，用預(yù)冷的甲醇固定10 min，隨后用0.1%（g/mL）結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗至背景干凈，拍照。

1.2.4 細胞凋亡實驗：NC shRNA組和Eg5 shRNA組是將NC shRNA及Eg5 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)DU145細胞以1× 106/mL接種在6孔板上，培養(yǎng)細胞48 h。SB-743921組是將處于對數(shù)生長期的DU145細胞以1×106/mL接種在6孔板上，待細胞貼壁后分別加入4.0 nmol/L和8.0 nmol/L的SB-743921繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h。待各組細胞處理結(jié)束后，收集細胞，PBS清洗細胞兩遍，用Annexin V-FITC室溫避光染細胞5 min，然后用PI對細胞染色5 min。標記了Annexin V-FITC和PI的細胞用流式細胞儀測定細胞凋亡情況。細胞凋亡數(shù)據(jù)用FlowJo 7.6軟件處理。

1.2.5 細胞周期檢測：NC shRNA組和Eg5 shRNA組，將對數(shù)生長期的NC shRNA及Eg5 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)DU145細胞以1×106/mL接種在6孔板上，待細胞貼壁后換液，培養(yǎng)48 h。SB-743921組將處于對數(shù)生長期的DU145細胞以1×106/mL接種在6孔板上，待細胞貼壁后分別加入4.0 nmol/L和8.0 nmol/L的SB-743921繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組細胞后，用PBS清洗細胞兩遍，隨后將各組細胞固定在70%的乙醇。待細胞固定之后，用含有RNAase A的PI染液室溫孵育細胞30 min，多余的PI用PBS清洗除去，上機測定細胞周期分布情況。細胞周期數(shù)據(jù)用ModFit LT3.3軟件分析。

1.2.6 劃痕實驗：NC shRNA組和Eg5 shRNA組，將對數(shù)生長期的NC shRNA及Eg5 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)DU145細胞以2×105/mL的濃度接種在6孔板中，待細胞貼壁后用移液器吸頭制造劃痕，將培養(yǎng)基換為含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h。SB-743921處理組，將處于對數(shù)生長期的DU145細胞按照2×105/mL的濃度接種在6孔板中，制造劃痕，為避免細胞凋亡對劃痕實驗的干擾，用4.0 nmol/L的SB-743921處理細胞48 h。用倒置顯微鏡拍照記錄細胞遷移情況，細胞遷移率（%）=（1-48 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度）×100%。

1.2.7 q-PCR實驗：待各組細胞培養(yǎng)48 h之后，收集細胞，用RNAiso Plus試劑提取總RNA。cDNA由1.0 μmol/L RNA通過R323 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到。q-PCR根據(jù)Q311試劑盒說明書要求進行。q-PCR通過real-time q-PCR儀測定各組細胞內(nèi)Eg5、c-Myc、SP1、CDK1、細胞周期蛋白Cyclin A1、細胞周期蛋白Cyclin B1、細胞分裂周期因子25B（cell division cycle protein 25B,CDC25B）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）以及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達的影響。溶解曲線分析中，以GAPDH基因作為內(nèi)參，使用2-△△Ct方法計算相對表達量。各基因引物序列見表1。

表1 q-PCR引物序列

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）實驗：待各組細胞培養(yǎng)48 h之后，收集細胞，用RIPA細胞裂解緩沖液在冰上裂解40 min后，離dSDS-PAGE凝膠電泳分離，并將分離得到的目標蛋白通過濕法電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。膜上的蛋白用5%（w/v）脫脂奶粉室溫封閉1 h，之后用一抗4 ℃孵育8 h，二抗室溫孵育1.5 h。最后，PVDF膜上的蛋白用增強化學(xué)發(fā)光液顯色，檢測系統(tǒng)檢測后，用ImageJ處理數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用Student’st檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Eg5表達和活性的抑制對前列腺癌細胞生長的影響 SB-743921組與對照組比，Eg5基因的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。Eg5抑制劑SB-743921處理細胞72 h之后，可顯著抑制3種細胞的生長（P＜0.05）。其中，SB-743921抑制DU145細胞生長的IC50值為（8.73±0.67）nmol/L，見圖2。通過考察不同時間SB-743921對細胞的生長抑制作用，發(fā)現(xiàn)SB-743921組和對照組比，可顯著抑制DU145細胞的生長（P＜0.05），見圖3。2.0 nmol/L的SB-743921組和Eg5 shRNA組與對照組和NC shRNA組比，細胞克隆數(shù)明顯減少（P＜0.05），見圖4。

圖1 DU145細胞內(nèi)Eg5表達情況

圖2 SB-743921抑制前列腺癌細胞增殖

圖3 不同時間DU145細胞生長情況

圖4 單克隆實驗測定DU145細胞增殖情況

2.2 Eg5表達和活性的抑制對DU145細胞凋亡的影響 Annexin V-FITC（+）/PI（+）和Annexin V-FITC（+）/ PI（-）分別表示細胞處在凋亡中晚期和凋亡早期階段，見圖5。NC shRNA組和對照組相比，組間細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Eg5 shRNA組、4.0 nmol/L和8.0 nmol/L SB-743921組與對照組相比，DU145細胞凋亡率均顯著增加（P＜0.05），見圖6。

圖5 DU145細胞凋亡情況

圖6 Eg5調(diào)節(jié)DU145細胞凋亡

2.3 Eg5 表達和活性的抑制對細胞周期的影響 NC shRNA組與對照組比，細胞周期分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。Eg5 shRNA組和SB-743921組與對照組比，細胞周期在G2/M期的含量均顯著增加（P＜0.05），見圖8。

圖7 DU145細胞周期分布

圖8 Eg5調(diào)節(jié)DU145細胞周期分布

2.4 Eg5表達和活性的抑制對DU145細胞遷移的影響 NC shRNA組與對照組相比，細胞遷移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Eg5 shRNA組和SB-743921組與對照組比，細胞遷移率均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖9。

圖9 Eg5調(diào)節(jié)DU145細胞遷移

2.5 q-PCR檢測Eg5對c-Myc、SP1、CDK1等基因表達的調(diào)節(jié)作用 NC shRNA組和對照組比，c-Myc、SP1、CDK1、Cyclin A1、Cyclin B1、CDC25B、N-cadherin、E-cadherin及Vimentin mRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Eg5 shRNA組和SB-743921組與對照組比，細胞內(nèi)c-Myc、SP1、CDK1 Cyclin A1、Cyclin B1、CDC25B、N-cadherin及Vimentin mRNA的相對表達量均降低（P＜0.05），E-cadherin的相對表達量均顯著增加（P＜0.05），見圖10。

圖10 qPCR分析DU145細胞內(nèi)c-Myc、SP1及相關(guān)基因的表達量

2.6 Western blot測定Eg5對DU145細胞內(nèi)c-Myc、SP1、CDK1等蛋白表達的影響 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)NC shRNA組和對照組比，c-Myc、SP1、CDK1、Cyclin A1、Cyclin B1、CDC25B、N-cadherin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Eg5 shRNA組和SB-743921組與對照組比，細胞內(nèi)c-Myc、SP1、CDK1 Cyclin A1、Cyclin B1、CDC25B、N-cadherin及Vimentin蛋白的表達量均降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白的表達量顯著增加（P＜0.05），見圖11。

圖11 Western blot檢測DU145細胞內(nèi)c-Myc、SP1及相關(guān)蛋白的表達量

3 討論

Eg5生物功能的阻斷，會引起細胞有絲分裂阻滯及細胞凋亡，是一個非常重要的藥物靶點[8-10]。與很多參與調(diào)節(jié)有絲分裂的因子不同，Eg5在正常組織細胞中的表達量極低，而在惡性腫瘤細胞內(nèi)的表達量卻很高[9]。Eg5在正常細胞及惡性腫瘤細胞內(nèi)的差異性表達導(dǎo)致靶向Eg5的療法不良反應(yīng)相對較低，是很好的抗有絲分裂療法。CRPC細胞內(nèi)存在Eg5的過度表達和活化，探究Eg5對CRPC細胞惡性增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用，可以為基于該類靶點的藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。然而，關(guān)于Eg5調(diào)節(jié)CRPC細胞增殖的研究很少。本研究初步探究了Eg5對CRPC DU145細胞惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用，同時評價了Eg5小分子抑制劑SB-743921對DU145細胞生長及轉(zhuǎn)移的影響，并對相應(yīng)的機制做了初步的探究。

本研究發(fā)現(xiàn)用Eg5 shRNA沉默Eg5在DU145細胞內(nèi)的表達或者用SB-743921抑制Eg5的功能，均能抑制3種前列腺癌細胞DU145、PC3和LNCap的惡性增殖。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Eg5表達和功能的抑制會促進DU145細胞凋亡，阻斷細胞周期G2期到M期的轉(zhuǎn)換并削弱細胞的遷移能力。多種基因調(diào)節(jié)細胞周期G2期到M期的轉(zhuǎn)換，其中周期蛋白依賴性激酶CDK1、Cyclin A1、Cyclin B1及CDC25B發(fā)揮關(guān)鍵作用。CDK1是細胞有絲分裂重要的調(diào)節(jié)，通過與細胞周期蛋白Cyclin A1 及Cyclin B1 來調(diào)節(jié)細胞周期G2到M期的轉(zhuǎn)換[15-16]。當CDK1表達降低，細胞周期會阻滯在G2/M期，繼而導(dǎo)致細胞無法進行有絲分裂而死亡[15]。細胞分裂周期因子CDC25B與CDK1一樣，也是參與細胞有絲分裂的重要因子，當CDC25B的表達量降低，會導(dǎo)致細胞周期阻滯在M期[15]。多種基因參與調(diào)節(jié)CDK1的表達和功能，其中轉(zhuǎn)錄因子SP1就被證實可以調(diào)節(jié)CDK1的表達[13-14]。Eg5是癌基因c-Myc的上游靶基因，研究表明Eg5表達和功能的抑制，會直接導(dǎo)致c-Myc表達量的降低[11，13]。而轉(zhuǎn)錄因子SP1是c-Myc的下游靶基因，與腫瘤的惡性增殖及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13-14]。因此，Eg5可能通過調(diào)節(jié)c-Myc的表達，進而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子SP1的表達和功能來調(diào)控CDK1等細胞周期相關(guān)蛋白的功能。基于此設(shè)想，本研究用q-PCR和Western blot評價了Eg5對c-Myc、SP1、CDK1、Cyclin A1、Cyclin B1及CDC25B表達的影響。q-PCR和Western blot結(jié)果同時證明，當Eg5表達和功能被抑制后，c-Myc、SP1以及參與調(diào)節(jié)G2到M期轉(zhuǎn)換的基因CDK1、Cyclin A1、Cyclin B1及CDC25B表達的均顯著降低。這表明，Eg5可能通過c-Myc/SP1/CDK1信號通路將細胞周期阻滯在G2/M期。

作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，特異性蛋白SP1通過調(diào)節(jié)多種通路來促進腫瘤的惡性進展[13]。除細胞周期，SP1還被證明參與調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。包括N-cadherin、Vimentin和E-cadherin在內(nèi)的多種基因參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[17]，而轉(zhuǎn)錄因子SP1被證明參與調(diào)節(jié)N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表達和功能來促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[17-18]。這表明，Eg5很可能是通過c-Myc間接的調(diào)節(jié)SP1的表達，繼而調(diào)節(jié)N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表達和功能來調(diào)控腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究q-PCR和Western blot結(jié)果表明，當Eg5表達和活性受到抑制，會導(dǎo)致細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因N-cadherin和Vimentin表達的降低以及E-cadherin表達的增加，繼而削弱腫瘤細胞的遷移能力。這表明，Eg5可能通過c-Myc/SP1信號通路來抑制CRPC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但具體的調(diào)節(jié)機制需要進一步驗證。

綜上所述，本研究初步探討了Eg5對CRPC細胞惡性增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機制，為以Eg5為靶點的小分子藥物設(shè)計提供理論基礎(chǔ)。