康復新液治療潰瘍性結腸炎小鼠的效果

金旭敏，孫潔，薛鵬鵬，董偉杰，陶信潔，徐荷林

溫州醫科大學，浙江 溫州 325035，1.實驗動物中心；2.藥學院；3.第一臨床醫學院

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種以黏膜炎癥和潰瘍形成為主要病理特征的慢性疾病[1-2]。UC發病機制目前不完全清楚，普遍認為與遺傳、環境等綜合因素導致的結腸黏膜屏障損傷有關[3-4]。目前臨床上UC治療仍以緩解炎癥反應的口服小分子藥物如抗炎免疫抑制和抗生素等為主要手段[5-6]，但不能防止炎癥的反復發作，而且多次治療容易使UC演進為更為頑固的炎癥病癥[7]。研究發現，康復新液（KFX）具有改善胃腸黏膜創面微循環和抑菌抗炎抗水腫的作用[8]，可以用于放射性直腸的治療[9]，但是KFX對結腸黏膜的屏障修復作用仍然缺乏一定的支持。本研究的KFX采用口服給藥，以地塞米松液體灌腸劑為陽性藥物[10]，通過對比評價KFX對UC的治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 葡聚糖硫酸鈉（DSS）購于美國Sigma公司；KFX（湖南科倫制藥有限公司）和地塞米松（DXM，國藥集團容生制藥有限公司）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）檢測試劑盒（武漢愛博泰克生物科技有限公司）。IL-6 兔多克隆抗體（DF6087，1:200，Affinity，江蘇親科生物研究中心有限公司）；IL-1β兔多克隆抗體[AB9722，1:200，Abcam?，艾博抗（上海）貿易有限公司]；TNF-α小鼠單克隆抗體[52B83，1:100，Santa Cruz?，Santa Cruz Biotechnology（上海）Co.，Ltd.]。SpectraMax M3酶標儀（美國Molecular Devices公司），Nikon正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），內窺鏡影像系統（SD-618型，沈陽沈大內窺鏡有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組：按照文獻[11-12]方法，4% DSS加入小鼠飲用水，連續喂養6 d，建立UC模型。模型建立后，小鼠出現毛發紊亂，大便疏松甚至便血，表現出明顯的UC癥狀。15只造模成功小鼠分為3組，每組5只，分別為口服0.9%氯化鈉溶液組（Saline組）、地塞米松溶液灌腸組（DXM組）和KFX口服組（KFX組），在第7天開始給藥治療。0.9%氯化鈉溶液或KFX，每次1 mL，每日3次灌胃給藥，連續治療7 d；DXM溶液以0.05 mg/kg劑量，每次0.1 mL，每日3次，用注射器經直腸3～4 cm處灌注給藥，給藥后倒置小鼠15 s，連續給藥7 d。治療期間每日觀察小鼠的體質量以及糞便情況，對其疾病活動指數（disease activity index,DAI）進行評分。治療終點，處死各組小鼠，分離結腸組織，觀察結腸外觀并測量其長度。體質量變化率（%）=第n天體質量/初始體質量。

1.2.2 結腸長度及MPO活性檢測：通過脾臟質量間接評價治療后UC小鼠整體炎癥的緩解情況[13]。治療終點（第13天）處死各組小鼠，收集小鼠脾臟稱重比較。收集整個結直腸觀察結直腸形態，并測量結腸長度。取距離肛門6 cm以上的結腸組織100 mg，組織勻漿器勻漿，10 000×g離心10 min，取上清液，利用試劑盒測定組織MPO活性。

1.2.3 結腸鏡觀察：麻醉小鼠后將灌胃針接在注射器上，對小鼠灌注1 mL 0.9%氯化鈉溶液進行腸道清洗。用少量甘油潤滑內窺鏡鏡頭，將鏡頭插入小鼠肛門，在電腦屏幕上進行觀察。在造模第6天、第10天以及第13天對小鼠的結腸表面形態進行內窺鏡觀察，對其表面形態進行評分比較。潰瘍評分：0分為無明顯潰瘍；1分為輕度充血、水腫、表面光滑、潰瘍散在分布數量1～2處；2分為黏膜粗糙呈顆粒狀、有糜爛水腫出血、潰瘍散在分布數量大于2處；3分為高度充血水腫、黏膜表面有壞死及部分區域潰瘍；4分為重度出血糜爛，明顯大面積潰瘍。炎癥評分：0分為無明顯炎癥；1分為黏膜細顆粒狀改變；2分為黏膜表面發紅、糜爛；3分為黏膜表面明顯潰瘍、出血；4分為黏膜表面大范圍潰瘍、出血。

1.2.4 HE、PAS及免疫組織化學和免疫熒光染色方法：取距離肛門6 cm以上的結腸組織，10%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，組織切片機切成厚度為5 μm的薄片，用HE染色、AB-PAS染色和免疫熒光染色，在光學顯微鏡下觀察組織形態。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行分析。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組治療效果比較 3組小鼠造模6 d內的體質量明顯減輕，并且Saline組在實驗結束時沒有恢復。第7天開始DXM組和KFX組小鼠出現不同程度的體質量上升，表明病變腸道功能逐漸恢復。KFX組小鼠的體質量較DXM組在第12天恢復得更接近初始體質量，表明該組病變腸恢復最好。Saline組小鼠DAI評分明顯升高，而DXM組和KFX組DAI評分隨著第7天開始治療逐漸下降，且KFX組的評分低于DXM組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1A、圖1B。整個治療過程中，Saline組中的小鼠出現軟糞便伴有輕微的腹瀉痕跡，并且嚴重程度逐漸增強，在肛門部位顯示水樣糞便和大出血。DXM組和KFX組小鼠第7天腹瀉和糞便出血明顯緩解，第8天2組小鼠糞便轉為正常，并未見出血癥狀。Saline組小鼠結腸出現明顯腫脹和萎縮；DXM組和KFX組小鼠結腸組織腫脹有所緩解，DXM組仍有數只出現不同程度的結腸萎縮；與DXM組比，KFX組結腸腫脹與萎縮有所減少；與Saline組比，DXM組和KFX組小鼠結腸長度明顯恢復，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1C、圖1D。Saline組小鼠出現明顯的脾臟腫大，DXM組和KFX組小鼠脾腫大有明顯緩解，KFX組與Saline組比差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1E。表明KFX組的治療能有效緩解UC小鼠免疫系統的激活。

圖1 3組對DSS誘導UC小鼠的治療效果比較

2.2 3組小鼠炎癥反應比較 Saline組小鼠結腸出現較高的MPO水平，DXM組和KFX組小鼠結腸組織MPO水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2A。這些結果表明，KFX治療可有效地緩解免疫細胞的激活，抑制中性粒細胞結腸組織的浸潤，緩解潰瘍性結腸的炎癥。

2.3 3組小鼠結腸形態比較 造模第5天，各組小鼠結腸均出現嚴重的潰瘍性糜爛，出現大面積的滲血和腫脹的黏膜，與觀察到的結腸炎嚴重程度、血便程度、結腸外觀相一致。第9天，DXM組和KFX組小鼠結腸均未見潰瘍性糜爛，但仍存在黏膜腫脹；Saline組小鼠的結腸仍可見滲血和大面積潰瘍。第13天，DXM組和KFX組小鼠結腸黏膜腫脹均有所緩解，展現出明顯的宏觀形態修復，見圖2B。潰瘍評分表明，與Saline組比，DXM組和KFX組小鼠的黏膜恢復明顯更好，差異有統計學意義（P＜0.05）。經DXM和KFX治療之后，腸鏡炎癥評分下降，與Saline組比差異有統計學意義（P＜0.05），表明DXM和KFX對潰瘍性結腸炎小鼠有明顯的治療效果，見圖2C、圖2D。

圖2 3組小鼠結腸炎癥及形態比較

2.4 3組小鼠組織形態比較 第14 天Saline組小鼠結腸出現隱窩膿腫或消失，黏膜下層和肌層水腫，炎性細胞浸潤。DXM組和KFX組治療后，隱窩形態有效修復，黏膜下層和肌層水腫有一定緩解，炎癥細胞浸潤有所減少。與DXM組比，KFX組展現出完整的黏膜上皮層、隱窩以及肌層黏膜和黏膜下層，相互間分界分明，各層組織未見明顯的腫脹與炎癥細胞浸潤，見圖3A。

與Saline組比，DXM組和KFX組的小鼠結腸組組織學評分均得到改善，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3B。Saline組出現明顯的杯狀細胞缺失和黏液分泌減少，而DXM組和KFX組均呈現出良好的杯狀細胞形態，表明有效改善了UC導致的杯狀細胞損傷；且與DXM組比，KFX組出現更完好的杯狀細胞的形態，見圖3C。與Saline組比，DXM組和KFX組AB-PAS陽性區域面積明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3D。表明DXM和KFX有效改善了杯狀細胞的缺失，增加了黏液的分泌。

圖3 3組修復DSS誘導UC的杯狀細胞

2.5 3組小鼠結腸組織的炎癥因子水平 在治療第14天，Saline組IL-1β、IL-6和TNF-α表達均明顯上升，DXM和KFX組治療后熒光表達均下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；且KFX組IL-1β、IL-6和TNF-α熒光強度均低于DXM組，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖4。熒光強度統計結果如圖4B所示，結果說明KFX和DXM均能夠有效地發揮抗炎作用，從而產生治療UC的效用，且KFX具有更好的抗炎效果。

圖4 3組小鼠結腸組織的炎癥因子水平

2.6 KFX修復DSS誘導的UC小鼠的黏膜屏障 如圖5 所示，在第14天Saline組結腸上皮層僅有微弱、分散的Claudin-5、ZO-1和Occludin-1相關熒光，表明細胞間緊密連接被嚴重破壞。DXM和KFX組治療后，結腸上皮層出現明顯的熒光，與Saline組比，KFX組中Claudin-5、ZO-1和Occludin-1的表達明顯升高，差異有統計學意義（均P＜0.01）；KFX組中Claudin-5、ZO-1和Occludin-1熒光強度明顯高于DXM組，差異有統計學意義（均P＜0.05），表明KFX組黏膜屏障修復得更為完整。

圖5 3組修復DSS誘導UC的黏膜屏障

3 討論

UC以黏膜炎癥和潰瘍為主要病理特征，臨床呈現反復發作不愈的特點，癌變風險高，預后差，已被WHO列為現代難治病之一[14]。持續或反復出現的結腸炎癥是導致結腸纖維化狹窄、結腸癌的重要原因[15]。目前臨床UC治療仍以小分子抗炎藥物和抗生素等緩解炎癥反應為主要手段，但不能防止炎癥的反復發作，缺乏有效的根治藥物。加之嚴重的藥物不良反應如腎損傷、免疫抑制引發的感染等，目前小分子藥物對UC的治療臨床獲益十分有限[16]。

KFX是以美洲大蠊干燥蟲體分離提取物精制而成的一種生物制劑[17]。現代藥理研究證實，KFX具有促進組織修復、抗炎、抑菌的作用，因此有望用于UC的治療。研究報道KFX治療消化性潰瘍有效率可達到93%[9]。KFX具有促進表皮生長因子表達以修復黏膜的作用，且可通過抑制AP-1、NF-κB、IL-4等炎性遞質的表達來達到全身及局部的抗炎作用[18]。

緊密連接蛋白廣泛分布于上皮、內皮、間皮細胞膜上，在細胞間組成分子屏障，調節分子和離子在細胞間隙的彌散。UC小鼠腸道黏膜上皮中，緊密連接蛋白結構和功能發生改變。Claudin-5、ZO-1和Occludin-1 蛋白在腸黏膜屏障功能維持中起重要作用。本研究進一步對治療后小鼠結腸組織進行Claudin-5、ZO-1和Occludin-1免疫熒光染色，以評價結腸黏膜修復情況，結果表明KFX對黏膜屏障有很好的修復作用。

本課題的KFX采用口服給藥方式，以DXM溶液灌腸作為對照組，對比評價KFX的黏膜屏障修復作用。與Saline組相比，DXM或KFX展現出較明顯的炎癥緩解，黏膜屏障結腸組織形態修復。而且KFX相比DXM展現出更為有效的治療效果，可能原因如下：①KFX具有促進組織修復、抗炎、抑菌的作用；②KFX具有促進表皮生長因子表達的作用，較DXM不良反應更少。