WT1基因在成人初發(fā)AML患者中的表達及臨床意義

阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼 努爾阿米娜·依明尼亞孜

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）主要是以造血干細胞惡性增殖分化不成熟的髓系原始細胞在骨髓和外周血中累積為特征的一種惡性疾病[1]。該病癥的臨床特征大多是感染、出血、貧血以及髓外浸潤。當(dāng)前國內(nèi)外就WT1基因在成人初發(fā)AML患者當(dāng)中的預(yù)后作用研究結(jié)果有所不同[2]，WT1（Wilms tumor 1）基因最初在腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究人員認為其與腎母細胞瘤的發(fā)病機制相關(guān)，部分研究人員還發(fā)現(xiàn)WT1能夠?qū)︼L(fēng)化基因與造血細胞增生的轉(zhuǎn)錄或激活進行調(diào)控，和AML等多類腫瘤性疾病關(guān)系密切，認為能夠?qū)T1作為白血病的特異性分子標志，并為AML的預(yù)后分層提供相關(guān)理論依據(jù)[3]。基于此，本次主要就WT1基因在維吾爾族成人初發(fā)AML患者當(dāng)中的表達及臨床意義進行探究，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料和方法

1.1 臨床資料

納入本次研究的40例對象均選自醫(yī)院2019年1—10月確診的初發(fā)維吾爾族成人AML [非急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）]患者，資料均經(jīng)倫理委員會審批，其中包括21例男性和19例女性，患者年齡18～68歲，平均發(fā)病年齡（42.58±10.50）歲，40例患者白血病的診斷均經(jīng)臨床癥狀、血常規(guī)、骨髓細胞學(xué)及組織化學(xué)染色、免疫分型、染色體核型分析確診，部分患者行融合基因檢測，符合MICM [形態(tài)學(xué)（morphology）、免疫學(xué)（immunology）、細胞遺傳學(xué)（cytogenetics）、分子特征（molecular）分型）] 診斷標準[4]，并進行FAB分型 [1976年法國（Franch）、美國（American）和英國（Britain）] 等三國血細胞形態(tài)學(xué)專家討論、制訂了關(guān)于急性白血病的分型診斷標準，簡稱FAB分型），包括M1（急性粒細胞白血病未分化型）、M2（急性粒細胞白血病部分分化型）、M3（急性早幼粒細胞白血病）、M4（急性粒-單核細胞白血病）、M5（急性單核細胞白血病）、M6（急性紅白血病）、M7（急性巨核細胞白血病），其中以M1、M4、M5較為常見。

1.2 治療方案

對患者實施誘導(dǎo)治療：采用蒽環(huán)類藥物，包括柔紅霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，國藥準字H44024361，規(guī)格：20 mg/支）、去甲氧柔紅霉素（國藥一心制藥有限公司，國藥準字：H20055127，規(guī)格：100 mg/支，）、聯(lián)合阿糖胞苷（國藥一心制藥有限公司，國藥準字：H20055127，規(guī)格：100 mg×10瓶）實施誘導(dǎo)化療，一共治療2個療程，若第1個療程之后仍未得到完全緩解（complete remissioon，CR），則實施第2個療程，并加用100 mg/m2依托泊苷（5 d重復(fù)1次），若2個療程以后仍無緩解，則代表治療失敗，若得以緩解則可以依據(jù)患者預(yù)后情況以及供者情況來選擇單純化療、微移植或者移植[5]。

1.3 WT1檢測

（1）對所有患者初診時以及CR（完全緩解）后的WT1表達水平，骨髓WT1表達水平采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）進行檢測。（2）制備樣品：基因組RNA的抽提采用RNA 提取試劑盒來進行，純度和濃度方面采用紫外分光光度計進行檢測，選取符合要求的標本保存在-20℃?zhèn)溆谩＃?）WT1基因水平檢測：PCR熱循環(huán)反應(yīng)條件：50℃ 2 min、95℃ 20 s、95℃ 3 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次，7次PCR完畢后，根據(jù)實際情況設(shè)置閾值線，分析擴增曲線。（4）結(jié)果分析：以WT1基因表達水平中位數(shù)0.583為界，＜0.583為WT1基因低表達，≥0.583為高表達[6]。

1.4 指標觀察

常見融合基因 [FLT3（Fms-like tyrosine kinase 3），NPM1（nucleophosmin 1），CEBPA（recombinant CCAAT / enhancer binding protein alpha），c-kit（c-kitproto-oncogeneprotein）] 定性篩查。分析各臨床參數(shù)和WT1的表達水平、分析WT1對總生存期（overall survival，OS）和無事件生存時間（event-free survival，EFS）的影響、分析WT1在誘導(dǎo)化療方面的影響。觀察并統(tǒng)計不同臨床特征AML患者骨髓WT1基因表達，觀察突變發(fā)生率，觀察生存情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

本研究所獲的所有數(shù)據(jù)均通過統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0統(tǒng)計處理，計數(shù)資料用（n，%）表示，用χ2檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料表示為（±s），采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的采用M（P25，P75）表示，采用非參數(shù)檢驗。若P＜0.05，提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各臨床參數(shù)和WT1的表達水平分析

40例AML患者治療前的WT1表達水平與其性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。40例患者不同臨床特征AML患者骨髓WT1基因的表達結(jié)果從FAB分型來看：M1的WT1基因表達百分數(shù)為95.65%；M4的WT1基因表達百分數(shù)為92.62%；M5 WT1基因表達百分數(shù)為93.14%，可見M1分型AML患者骨髓WT1基因的表達百分數(shù)最高。詳見表2。

表1 40例AML患者WT1基因表達與年齡、性別比較 [M（P25，P75）]

表2 AML患者骨髓WT1基因的表達結(jié)果對比

2.2 分析WT1在誘導(dǎo)化療方面的影響

采用完全緩解（CR）率進行評估，以WT1基因表達水平中位數(shù)0.583為界，＜0.583為WT1基因低表達，≥0.583為高表達，并將患者分成高表達組和低表達組，40例患者中達到CR比例為85.00%（34/40），高表達組CR率為70.59%（12/17），低表達組CR率為95.65%（22/23），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），由此說明WT1基因低表達的AML 患者，化療治療中完全緩解率更高。見表3。

表3 不同表達組患者CR率對比（%）

2.3 分析WT1對OS和EFS的影響

40例患者中WT1高表達組（n=17）、WT1低表達組（n=23），高表達組1年的EFS率和OS率分別為17.65%和35.29%，低表達分別為47.83%和69.57%，40例患者中最終達到緩解的有34例，其中，行非清髓造血干細胞移植的有6例、微移植治療的有18例、緩解后單純化療的有10例。此外，選取緩解之后采用微移植治療的18例患者進行WT1表達分析，低表達組12例，高表達組6例；對初診時WT1水平和總生存之間的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示高表達組1年總生存率（33.33%，2/6）仍然較低表達組（50.00%，6/12）低，由此說明，WT1基因低表達的AML患者，EFS率與OS率均較高表達者高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。通過1～6個月的誘導(dǎo)化療以后，相較于初治時，WT1水平降低1個數(shù)量級以上的患者1年總生存率顯著提高。見表4。

表4 不同表達組患者OS和EFS對比（%）

2.4 分析突變發(fā)生情況及生存情況

FLT3-ITD突變4例，突變發(fā)生率為10.00%；NPM1突變3例，突變發(fā)生率為7.50%；CEBPA突變未發(fā)生突變；C-KIT突變未發(fā)生突變；40例患者平均生存時間為（5.17±1.49）月。

3 討論

WT1定量表達的調(diào)整（上調(diào)/下調(diào)）與造血干細胞的生長分化、數(shù)量以及生存方面有著密切的聯(lián)系，該基因具備癌基因特性，不僅在幼稚細胞中高表達，還能對幼稚細胞的分化加以抑制[7]。當(dāng)前研究已經(jīng)證實在近10%的初發(fā)AML患者當(dāng)中WT1具有高表達，但就WT1高表達和AML患者的預(yù)后及生存率的關(guān)系說法不一[8]。

本次研究結(jié)果顯示：WT1表達的高低和患者性別、年齡、AML危險分層等方面無顯著相關(guān)性，WT1基因高表達與AML患病率呈正相關(guān)。

相關(guān)研究[9]報道顯示AML患者在初治時的WT1水平往往會比較高，而到了完全緩解期會顯著降低，但若復(fù)發(fā)，則會在復(fù)發(fā)前再次升高。所以，可將其作為監(jiān)測MRD的重要指標[10]。在本次研究當(dāng)中，針對患者治療后期進行了追蹤隨訪，結(jié)果與上述規(guī)律相符。其次，一部分研究則認為以上二者之間無關(guān)聯(lián)[11]。WT1的水平在初治療階段無顯著變化，則代表患者會復(fù)發(fā)或未達到緩解，同時生存期也有一定的縮短。本次研究的FAB分型結(jié)果顯示40例患者當(dāng)中M1有5例、M4有4例，M5有7例，而以上三者的WT1基因表達百分數(shù)均在92%以上，還發(fā)現(xiàn)AML-M3患者骨髓WT1基因表達水平同患者的預(yù)后無相關(guān)性，F(xiàn)AB分型中僅M3未出現(xiàn)，這可能和該亞型的靶向治療藥物應(yīng)用存在關(guān)聯(lián)性，由此，可以看出WT1基因高表達不是本癥發(fā)病機制，究其原因可能與轉(zhuǎn)錄因子改變相關(guān)，而影響到下游基因的表達[12]。

當(dāng)前臨床中隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛運用，可以采用新型基因突變來更好的檢測急性髓系白血病患者的治療及預(yù)后情況，并且這些基因突變中FLT3-ITD和NPM1的突變率最高，這與本次研究結(jié)果一致，在本次研究中NPM1突變主要存在于M4EO、M1和M5中，而FLT3-ITD突變主要存在于M1、M4和M5中，骨髓原始細胞比例中位數(shù)和陰性患者之前無相關(guān)性，但觀察突變陽性患者發(fā)現(xiàn)其白細胞中位數(shù)較陰性患者要高[13]。

綜上所述，WT1基因在成人初發(fā)急性髓系白血病患者中的表達能夠用于判斷病情的進展及復(fù)發(fā)情況，在研究白血病患者治療方案上發(fā)揮了重要的作用。