凝血因子F XII 46 C→T基因多態性與急性心肌梗死研究

田孟茶 陳雅斌 吳聰蓮

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠狀動脈急性、持續性地缺血、缺氧所引起心肌壞死，屬于冠心病重要類型和嚴重狀態。目前研究認為AMI的發生是遺傳與環境相互作用的結果，除了年齡、吸煙、高血脂、高血壓等常見危險因素外，ApoE的E4等位基因、HIF1a的rs2057482位點多態性也可促進AMI的早發[1]。部分凝血因子的基因多態性也已經被研究證明與AMI的發生存在相關性[2-3]，其中凝血因子XII（coagulation factor XII，XII）啟動子區第46位核苷酸C→T（F XII 46 C→T）的基因多態性研究亦見少量報道，但研究結論卻并不相同[4-7]。劉媚娜等[5]提出該基因多態性可能存在種族、地域上的差異，因此，為了研究本地區F XII 46 C→T基因多態性與AMI是否存在相關性，本研究對72例AMI患者的F XII 46 C→T基因多態性及血漿FⅫ活性（F XII activity，F XII：C）水平進行了檢測，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年9月—2020年3月就診于醫院心內科，按照世界衛生組織對心肌梗死的診斷標準[6]，臨床確診為AMI的患者72例，其中男性39例，女性33例，年齡31～91歲，平均年齡（61±12）歲。所有病例均排除肝臟疾病、血液病等與凝血因子相關的疾病。并選取同時期就診于我院體檢中心，經影像學和實驗室檢查各項表征均正常、無動脈斑塊，無心血管、肝臟、血液病病史，性別、年齡和疾病組相匹配的體檢人群50例作為健康對照組，其中男性26例，女性24例，年齡24～76歲，平均年齡（59±13）歲。兩組患者一般資料對比，P＞0.05，差異無統計學意義。本研究經過醫院醫學倫理委員會批注通過。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 疾病組均在初診未用藥前及健康對照組體檢當日采集靜脈血，采用0.109 mol/ L枸櫞酸鈉1：9抗凝，充分顛倒混勻后，以3 000 r/min的速度離心15 min。上層血漿用于F XII：C水平的檢測，下層血細胞用于DNA提取，檢測F XII 46 C→T基因多態性。

1.2.2 基因多態性檢測 使用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按照說明書提取外周血DNA。引物序列：上游5′-CCCACAAACTCCCAACTTTCCG，下游5′-CCCCGTTGTCTTCTTAAGGCC。PCR擴增：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，92 ℃延伸30 s，總共進行30個循環。所得擴增產物用直接測序法進行DNA測序。引物交由上海生工生物工程股份有限公司合成，Taq酶由日本TaKaRa公司提供，PCR擴增儀為德國 Eppendorf公司產品。PCR擴增產物送深圳華大基因科技有限公司進行測序。

1.2.3 F XII：C水平的檢測 在Sysmex 7000 全自動血凝儀采用一期凝固法進行F XII：C的檢測。儀器所用試劑均為原廠配套，且均在有效期范圍內使用。每次標本檢測前均進行質控，保證檢測結果的準確性方可進行標本檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0進行數據統計分析，基因型分布采用遺傳平衡（Hardy-Weinberg）定律檢驗。χ2檢驗用于兩組基因型和等位基因頻率的比較。正態性分析顯示F XII：C水平數據為正態分布，因此用（±s） 表示，兩組間水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗，不同基因型之間水平的比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 遺傳平衡（Hardy-Weinberg）定律檢驗

AMI組和健康對照組進行遺傳平衡（Hardy-Weinberg）定律檢驗，符合遺傳定律平衡（χ2=1.241，P=0.265），具有群體代表性。

2.2 兩組 F XII 46 C→T基因多態性頻率分布的比較

F XII 46 C→T基因多態性中CC、CT、TT基因測序圖見圖1（a-c）。兩組F XII 46 C→T基因型分布和等位基因頻率見表1，結果顯示AMI組患者的CC基因型百分頻率明顯低于CT基因型和TT基因型。但與健康對照組相比，三種基因型的分布頻率差異并無統計學意義（χ2=2.362，P=0.307）。等位基因頻率比較，兩組之間C、T基因分布差異亦無統計學意義（χ2=2.340，P=0.126）。

圖1 F XII 46 C→T基因多態性測序圖

表1 AMI組患者與健康對照組F XII C46T基因型和等位基因頻數比較 [例（%）]

2.3 不同基因型F XII：C水平的比較

AMI組各項基因型與健康對照組相比，差異均有統計學意義（見表2），且AMI組內CC基因型F XII：C水平，均高于CT基因型和TT基因型（tcc，CT=13.039 1，Pcc，CT=0.009，tcc，TT=14.305 0，Pcc，TT=0.002），CT基因型與TT基因型 之間則無明顯差異，tCT，tt=1.669 2，PCT，tt=0.322。

表2 兩組不同基因型F XII：C水平（±s）

表2 兩組不同基因型F XII：C水平（±s）

注：*表示與健康對照組比較，P＜0.05；#表示在組內與CC基因型比較，P＜0.05

組別 CC CT TT 合計AMI組（n=72） 118.60±18.17 70.92±24.76#63.77±26.61#67.08±27.58*健康對照組（n=50） 95.90±10.89 84.38±6.95 66.89±11.99 77.08±14.67 t值 7.897 9 3.738 8 0.775 5 2.347 8 P值 0.000 0.000 0.000 0.021

3 討論

F XII是一種由肝臟合成的絲氨酸蛋白酶原[8]，是啟動內源性凝血途徑必須的凝血因子，對于機體凝血過程和纖溶過程十分重要，有著無法替代的作用。在缺乏F XII時，活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）顯著延長，但是在臨床上并不會引起明顯的出血傾向，相反有發生血栓形成的危險[9]。其基因啟動子區第46位核苷酸存在一個常見的多態性C→T（F XII 46 C→T），已被證明與較多血栓性疾病存在相關性[10-11]，與AMI的相關性亦有少量研究報道[4-7]，但研究結論在不同種族不同地區差異較大。因此，為了明確本地區F XII 46 C→T基因多態性與AMI是否存在關聯，為本地區的臨床診療提供研究資料，本研究對72 例AMI患者進行了基因測序分析。

研究顯示，AMI組與健康對照組的F XII 46 C→T基因野生型（CC）頻率均低于突變雜合型（CT）和突變純合型（TT），兩組均以突變純合型（TT）為主要基因型，占比分別為72.22%和62.00%。該研究結論和劉媚娜等[5-6]研究結論一致，但有研究顯示，2 615例歐洲人群中卻以野生型（CC）為主要基因型，占比57%，高于CT和TT基因型總和（43%）[12]。說明F XII 46 C→T基因多態性存在明顯的種族、地域差異：在中國該基因位點易發生C→T的突變，基因型以純合突變型（TT）為主要基因型。另一方面，AMI組與健康對照組基因型分布頻率差異并無統計學意義，C、T等位基因頻率上兩組亦沒有差異。因此研究認為本地區F XII 46 C→T的基因多態性與AMI無顯著相關性。該結論亦和劉媚娜等[5]研究溫州地區、云南地區AMI和F XII 46 C→T基因多態性，得出“二者無顯著關聯”的結論一致。

AMI組F XII：C水平總體低于健康對照組。同時，在不同基因型F XII：C水平的比較中，可見AMI組內CC基因型F XII：C水平高于CT基因型和TT基因型，差異具有統計學意義，但CT基因型與TT基因型之間F XII：C水平無差異。研究認為F XII 46的C→T基因突變會降低F XII：C水平，有可能進一步導致纖溶活性下降，通過影響凝血和纖溶過程而促進血栓的形成，或可能是AMI發生的原因之一。在既往研究中有學者指出F XII活性降低是冠心病和急性冠脈綜合征的獨立危險因素[12]，因此本研究還有待于擴大標本量，收集更多的臨床數據，進一步研究F XII：C水平與AMI的相關性。

綜上所述，F XII 46C→T基因多態性與AMI的發生無顯著相關性。但F XII 46的C→T基因突變有可能降低F XII：C水平，成為促進AMI發生的因素之一。