抗-HCV篩查反應性HCV核酸陰性獻血者的確證結果分析*

秦偉斐，楊丹蓉，段恒英，黃 霞

(重慶市血液中心 400015)

為保障血液安全，我國《血站技術操作規程(2019版)》對獻血者病毒感染標志物篩查作了明確規定：丙型肝炎病毒(HCV)感染標志物應至少采用核酸和血清學試劑各進行1次檢測。血液篩查應盡可能選用高敏感性試劑，因試劑的特異性有所降低，會存在一定的生物學假陽性，低危險無償獻血人群其假陽性比例更高[1]。假陽性結果會給獻血者帶來心理負擔，同時造成血液資源的浪費。另一方面，核酸篩查HCV核酸陰性獻血者中也存在一定比例的假陰性，對血液安全構成威脅。本研究通過對重慶地區122份抗-HCV篩查呈反應性且HCV核酸陰性獻血者的確證結果進行分析，探討現有篩查策略的安全性及開展獻血者歸隊的必要性，為獻血者篩查策略的選擇和獻血者歸隊提供科學依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1-12月本血液中心經ELISA試劑檢測抗-HCV抗體反應性、HCV核酸檢測陰性的122份無償獻血者標本為研究對象。

1.2 方法

1.2.1試劑

ELISA試劑：抗-HCV(北京萬泰、美國強生)。HCV重組免疫印跡確證試劑：HCV BLOT 3.0(美國MP公司)。

1.2.2儀器

全自動樣品處理儀(Xan-Tus)；全自動酶聯免疫分析系統(Microlab FAME24/20)；PROCLEIX TIGRIS 核酸檢測系統(西班牙Grifols公司)；全自動蛋白印跡儀ProfiBlot48(瑞士帝肯公司)。

1.2.3檢測流程

上述標本同時進行ELISA和核酸檢測，對ELISA試劑反應性且核酸檢測呈陰性的標本進行HCV確證試驗。

1.2.4血清學ELISA檢測與結果判定

加樣器自動加樣后，用全自動酶聯免疫分析儀對抗-HCV進行雙試劑2次ELISA法檢測，依據《血站技術操作規程》規定的標準和試劑說明書及工作手冊進行結果判定。S/CO≥0.8判為有反應性，其中S/CO≥0.8～<1.0設置為灰區。雙試劑S/CO≥0.8，直接判為陽性；單試劑有反應性的標本采用原試劑對標本管進行雙孔復試，任意一孔有反應性則判為陽性。

1.2.5確證試驗檢測與結果判斷

將需要進行確證試驗的標本按HCV確證試劑HCV BLOT 3.0的操作說明書和全自動蛋白印跡儀ProfiBlot 48的操作程序進行操作，結果判斷依據按試劑說明進行。其條帶強度的判讀和結果的解釋如下：未出現HCV抗體特異條帶強度+及以上判為陰性，至少出現2條強度+及以上或出現1條核抗原條帶++及以上判為陽性，僅出現1個HCV抗體特異條帶強度+及以上判為不確定。陽性預測值是指陽性檢測結果為真陽性的概率，即陽性預測值=真陽性/(真陽性+假陽性)。

1.3 統計學處理

采用SPSS19.0軟件進行數據分析，計數資料以頻數或百分率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ELISA試劑檢測抗-HCV反應性標本的確證試驗結果

ELISA試劑檢測抗-HCV呈反應性標本的確證試驗結果中各陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=23.801，P<0.05)，見表1。

表1 ELISA試劑檢測抗-HCV反應性標本的確證試驗結果

2.2 確證試驗條帶分布及組合情況

試劑1、2經確證陽性標本，條帶主要是核心區核抗原蛋白區帶，其次是非結構NS4蛋白區帶，區帶反應強度組合主要是核抗原蛋白區帶和核抗原+NS4，見表2。

表2 確證試驗條帶分布及組合情況

2.3 不同區間S/Co呈陽性反應的標本與確證試驗結果的關系

隨著S/Co增高，陽性預測值也增高。但試劑1、2經確證試驗確證的陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=0.904，P>0.05)，見表3。

表3 不同區間S/Co呈陽性反應的標本與確證試驗結果的關系

續表3 不同區間S/Co呈陽性反應的標本與確證試驗結果的關系

3 討 論

HCV感染的實驗室診斷主要為檢測HCV抗體、抗原或HCV核酸。由于ELISA法具有操作簡單、靈敏度高、成本低、適用于批量檢測等優點[2]，目前國內血液篩查中均采用了該方法進行抗-HCV抗體檢測，已有研究報道抗-HCV ELISA試劑靈敏度和特異度均超過99%[3]。但該方法在具有較高靈敏度的同時，也會產生一定的假陽性，國外報道假陽性率大于26%，有的甚至高達50%以上[4]。因此，美國疾病預防控制中心建議，抗-HCV ELISA反應性的標本需采用重組免疫印跡確證或核酸檢測結果陽性可報告確證結果[5]。近年來，國內的采供血機構對獻血者進行了HCV核酸檢測的全覆蓋，發現無償獻血人群中存在一定比例的抗-HCV篩查反應性而HCV核酸陰性的獻血者，對此類獻血者的處理及后續的歸隊策略引起了大多數研究者的關注。

本課題組采用重組免疫印跡對此類獻血者進行HCV確證試驗，結果顯示在122份標本中，ELISA試劑1單反應性的確證陽性率為0，ELISA試劑2單反應性為25.93%，試劑1、2均反應性為47.06%，總體確證的陽性率為31.15%，不確定率為34.43%，這表明ELISA試劑檢測抗-HCV反應性對于篩查HCV感染仍具有重要意義，兩種ELISA試劑同時檢測能最大限度降低核酸檢測的漏檢率。另一方面，確證試驗結果中假陽性率為34.43%，與KODANI等[6]和陳少彬等[7]報道的抗-HCV ELISA試劑假陽性率接近，表明現階段采用的兩種不同廠家的ELISA試劑檢測在彌補試劑差異和減少人為誤差的同時，也增加了HCV初篩結果的假陽性率。為進一步提高輸血安全，目前國內血站已進行核酸檢測全覆蓋[8]。HCV核酸檢測不僅靈敏度高且特異度好，陽性說明血液中含有HCV病毒，也具有傳染HCV病毒風險。引進核酸檢測也可明顯縮短HCV檢測的“窗口期”，降低經輸血傳播HCV的概率[9]。但由本研究結果可知，部分ELISA陽性而核酸檢測陰性的標本仍不能排除HCV感染的可能，因此，血清學和核酸檢測在血液篩查中互為補充、缺一不可。根據《血站技術操作規程(2019版)》規定，HCV感染標志物應至少采用核酸和血清學試劑各進行1次檢測的要求，至于要選擇“1遍ELISA”還是“2遍ELISA”的篩查策略，這就要求各血站應根據自己的數據進行成本效益的分析，結合技術水平和人力物力等條件來制訂不同的篩查策略，權衡篩查效果和成本的關系，做出最好的選擇來降低輸血風險[10]。

確證試驗結果顯示，確證檢測條帶數越多，確證的陽性率越高，說明初篩抗-HCV反應性標本的確證陽性率與確證檢測條帶數、條帶強度一致，結合確證試劑檢測條帶數、條帶強度對結果進行判定可提高陽性預測值的準確性[11]。此外，S/Co越高，陽性預測值也就越高。文獻報道Ortho HCV 3.0ELISA試劑在其檢測標本S/Co≥3.8時，陽性預測值超過95%[12]，本研究結果顯示兩種ELISA試劑檢測結果陽性預測值低于張雪梅等[13]報道的98.02%和98.92%，這可能與本研究均為核酸檢測陰性標本有關。研究結果顯示ELISA試劑1的S/Co≥5.0的確證陽性率僅為82.35%，這就需要進一步確定試劑1最佳屏蔽閾值。ELISA試劑2的S/Co≥5.0的確證陽性率為100.00%，提示這部分獻血者可以直接屏蔽。所以，在制訂反應性獻血者屏蔽與歸隊時，可以根據不同抗-HCV ELISA試劑的S/Co作為預測HCV感染真陽性結果的參考閾值。本研究顯示2種ELISA試劑在灰區均有確證陽性，說明本實驗室HCV這個項目設置灰區是有必要的，與王瑞等[14]報道的可以取消灰區設置不一致。這與實驗室環境、儀器設備性能、試劑廠家、操作程序等不同有關，因此，是否設置灰區及其設定值應根據不同實驗室進行驗證。

按照目前的篩查策略，任意1次篩查結果為陽性的血液標本均視為不合格血液，基本上沒有開展確證試驗便使該獻血者被屏蔽，導致一定數量的健康獻血者被永遠屏蔽，終身失去了獻血的資格，既減少了血源，又給獻血者造成嚴重心理負擔。《反應性獻血者屏蔽與歸隊指南》的出臺，對于解決這類問題提供了依據和路徑，作為血液安全的篩查者或研究者，需要思考的是采用何種檢測試劑、何種篩查策略能為獻血者屏蔽或歸隊提供科學依據[15]。根據《反應性獻血者屏蔽與歸隊指南》，對核酸檢測陽性和抗-HCV ELISA雙試劑均呈反應性的直接屏蔽，但對于ELISA試劑單反應性的這部分獻血者，可根據不同試劑S/Co閾值來預測，S/Co大于或等于最佳閾值的直接屏蔽，S/Co小于最佳閾值的進入歸隊流程，這樣能有效減少不必要的獻血者屏蔽。在確保血液安全的同時，有必要進行隨訪，給獻血者提供相對準確、可靠的檢測結果，增加對獻血者的關愛，提高獻血服務的質量[16]。當然，面對抗-HCV篩查反應性但HCV核酸陰性獻血者，增加確證試驗應該是一條可行路徑，但又面臨技術、人員、成本、時間等多方面考量，需要綜合評判。

綜上所述，在獻血人群中同時采用2遍ELISA和核酸檢測，并在ELISA檢測中設灰區的篩查策略能最大限度降低輸血感染HCV的風險，保障血液安全。但假陽性將導致獻血者被屏蔽，開展HCV確證試驗有助于指導獻血者歸隊，也可提高獻血服務的質量。