sEH抑制劑激活EPCs促進(jìn)梗死心肌Ⅷ因子生成的研究*

王振河，姜德謙，許丹焰△

(1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建廈門 361003；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科，長沙 410011)

環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)可促進(jìn)缺血組織生成新生血管[1]，可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)EETs被迅速降解[2]。因此，使用sEH抑制劑可抑制EETs迅速降解，有效增加EETs在細(xì)胞內(nèi)濃度和效用[3-4]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表達(dá)過氧化物酶增殖體激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ,PPAR-γ)[5]，且EETs是PPAR-γ內(nèi)源性激動劑[6]。所以，sEH抑制劑t-AUCB可降低EPCs的EETs降解，增強(qiáng)EPCs的PPAR-γ表達(dá)水平及活性，促進(jìn)EPCs對梗死心肌血管生成作用的影響。本研究通過檢測t-AUCB干預(yù)的EPCs移植后不同時間點梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子的表達(dá)情況，驗證t-AUCB對EPCs促進(jìn)梗死心肌血管生成功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

80只清潔級實驗雄性小鼠，6周齡，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實驗動物中心提供。EPCs表面分化抗原購自英國Beckmancoulte公司；免疫組織化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司，分析純試劑；Ⅷ因子購自英國Beckmancoulte公司。

1.2 方法

1.2.1實驗分組

直接注射不同濃度(0、1、10、50、100 μmol/L)t-AUCB的小鼠作為t-AUCB組。PPAR-γ阻斷劑GW9662(5 μmol/L)預(yù)干預(yù)30 min后，再加入100 μmol/L t-AUCB干預(yù)的小鼠作為GW9662+t-AUCB組。

1.2.2EPCs的分離、培養(yǎng)

75%乙醇溶液處死小鼠，消毒，無菌條件下去除小鼠脛骨及股骨肌肉及皮毛，1 mL注射器抽取無菌生理鹽水，沖出小鼠四肢長骨骨髓，密度梯度離心5 min，吸取中間單個核細(xì)胞，按5×105/mL密度轉(zhuǎn)移至包被有大鼠Fibronectin 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入含5%胎牛血清和生長因子的EBM-2培養(yǎng)基，4 d后全量換液，隔天半量換液，倒置相差顯微鏡下觀察不同時間點細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3EPCs的鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，加入Dil-ac-LDL(10 mg/L)染色，觀察細(xì)胞攝取Dil-ac-LDL結(jié)果；流式細(xì)胞儀檢測EPCs表面分化抗原CD34、CD133、CD31、Flk-1表達(dá)情況。

1.2.4心肌梗死模型制作

小鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，氣管插管，小鼠呼吸機(jī)輔助呼吸，行術(shù)前心電圖檢查；75%乙醇溶液消毒，沿著胸骨左緣5～6肋間隙剪開皮毛及肌肉、心包，暴露心臟，沿左心耳與肺動脈圓錐交界處下方2～3 mm處進(jìn)針，深度為1～2 mm，7-0尼龍線結(jié)扎左前降支，縫合，觀察小鼠心肌搏動及顏色是否發(fā)生變化，復(fù)查心電圖，肌內(nèi)注射青霉素2萬單位，日光燈照下飼養(yǎng)。

1.2.5免疫組織化學(xué)

心肌梗死模型制作后1 h，尾靜脈注射200 μL外周培養(yǎng)7 d的1×106/mL EPCs細(xì)胞懸液，于注射后1、3、7、14、28 d處死小鼠，開胸，取出心臟，洗凈心腔血液，甲醛固定，切片，行免疫組織化學(xué)檢測心肌梗死后各組梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 小鼠EPCs的生長情況

離心分離至培養(yǎng)瓶時，培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞呈懸浮狀，種類繁多，少量可聚集；培養(yǎng)24～48 h，懸浮的細(xì)胞開始貼壁；培養(yǎng)4 d后倒去培養(yǎng)瓶內(nèi)液體，倒置顯微鏡下觀察，可見貼壁生長的細(xì)胞開始形成菊花狀集落，集落形態(tài)表現(xiàn)為外周梭形細(xì)胞包圍中央圓形細(xì)胞；培養(yǎng)7 d后中央圓形細(xì)胞逐漸向梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化；培養(yǎng)8 d后開始出現(xiàn)索狀細(xì)胞；培養(yǎng)10 d EPCs在培養(yǎng)板上逐漸融合，并向類圓形和多角形鋪路石樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，見圖1。

A:培養(yǎng)4 d；B:培養(yǎng)7 d；C:培養(yǎng)8 d；D:培養(yǎng)10 d。

2.2 小鼠EPCs攝取Dil-ac-LDL能力

培養(yǎng)的EPCs加入Dil-ac-LDL干預(yù)后，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下，EPCs攝取Dil-ac-LDL后顯示紅色熒光，結(jié)果顯示Dil-ac-LDL細(xì)胞攝取率達(dá)95%以上，見圖2。

2.3 小鼠EPCs表面分化抗原流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測小鼠EPCs細(xì)胞表面分化抗原表達(dá)情況，CD34為(53.89±0.34)%，CD133為(52.79±0.67)%，CD31為(36.67±0.93)%，F(xiàn)lk-1為(43.88±0.49)%。

A：培養(yǎng)8 d未行Dil-ac-LDL干預(yù)細(xì)胞；B：干預(yù)后攝取Dil-acLDL陽性細(xì)胞，顯示紅色熒光。

2.4 制作小鼠心肌梗死模型及心肌梗死前后心電圖變化

消毒麻醉及暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支制作心肌梗死模型，結(jié)扎瞬間可見結(jié)扎部位以下心肌變白，活動幅度明顯減弱。結(jié)扎冠狀動脈左前降支前，前壁導(dǎo)聯(lián)的ST段位于等電位線，結(jié)扎左前降支后復(fù)查心電圖可見前壁導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高，損傷電流產(chǎn)生，表明心肌梗死模型制作成功，見圖3。

2.5 不同濃度t-AUCB干預(yù)的EPCs注射后不同時間梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況

2.5.1不同濃度t-AUCB干預(yù)的EPCs注射后1 d梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況

0 μmol/L t-AUCB組可檢測到少量Ⅷ因子表達(dá)，隨著濃度增加，梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)水平逐漸增加，GW9662+t-AUCB組較100 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)水平明顯減少。與0 μmol/L t-AUCB組比較，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)水平明顯增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB組與0、100 μmol/L t-AUCB組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、表1。

2.5.2不同濃度t-AUCB干預(yù)的EPCs注射后3 d梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況

0 μmol/L t-AUCB組3 d Ⅷ因子表達(dá)較干預(yù)1 d有所增加，但總體表達(dá)水平仍較少，隨著濃度增加，梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)水平逐漸增加，GW9662+t-AUCB組較100 μmol/L t-AUCB組，Ⅷ因子表達(dá)水平明顯減少。與0 μmol/L t-AUCB組比較，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)水平明顯增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB組與0、100 μmol/L t-AUCB組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5、表1。

A：開胸，撐開心包，暴露左心耳；B：左心耳下1～2 mm處結(jié)扎冠狀動脈左前降支;C：結(jié)扎前心電圖；D：結(jié)扎血管后心電圖。

表1 不同濃度t-AUCB干預(yù)的EPCs注射后不同時間點梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況

A：0 μmol/L t-AUCB組；B：1 μmol/L t-AUCB組；C：10 μmol/L t-AUCB組;D:50 μmol/L t-AUCB組;E:100 μmol/L t-AUCB組；F:GW9662+t-AUCB組。

2.5.3不同濃度t-AUCB干預(yù)的EPCs注射后7 d梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況

0 μmol/L t-AUCB組7 d Ⅷ因子表達(dá)較前增多，但量仍較少，隨著濃度增加，梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)水平開始大幅度增加，10、50 μmol/L t-AUCB組間跨越幅度最大；GW9662+t-AUCB組較100 μmol/L t-AUCB組，Ⅷ因子表達(dá)水平明顯減少，為0～1 μmol/L。與0 μmol/L t-AUCB組比較，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)水平明顯增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB組與0、100 μmol/L t-AUCB組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6、表1。

A：0 μmol/L t-AUCB組；B：1 μmol/L t-AUCB組；C：10 μmol/L t-AUCB組;D:50 μmol/L t-AUCB組;E:100 μmol/L t-AUCB組；F:GW9662+t-AUCB組。

2.5.4不同濃度t-AUCB干預(yù)的EPCs注射后14 d梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況

0 μmol/L t-AUCB組14 d Ⅷ因子表達(dá)緩慢增加，隨著濃度增加，梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)水平大幅度增加，增加幅度較3、7 d更大，GW9662+t-AUCB組較100 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)水平明顯減少。與0 μmol/L t-AUCB組比較，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)水平明顯增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB組與0、100 μmol/L t-AUCB組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7、表1。

2.5.5不同濃度t-AUCB干預(yù)的EPCs注射后28 d梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況

0 μmol/L t-AUCB組28 d Ⅷ因子表達(dá)仍緩慢增加，隨著濃度增加，梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)水平增加，增加幅度較7、14 d有所放緩，GW9662+t-AUCB組較100 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)水平明顯減少。與0 μmol/L t-AUCB組比較，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)水平明顯增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB組與0、100 μmol/L t-AUCB組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖8、表1。

A：0 μmol/L t-AUCB組；B：1 μmol/L t-AUCB組；C：10 μmol/L t-AUCB組;D:50 μmol/L t-AUCB組;E:100 μmol/L t-AUCB組；F:GW9662+t-AUCB組。

A：0 μmol/L t-AUCB組；B：1 μmol/L t-AUCB組；C：10 μmol/L t-AUCB組;D:50 μmol/L t-AUCB組;E:100 μmol/L t-AUCB組；F:GW9662+t-AUCB組。

3 討 論

骨髓來源單個核細(xì)胞貼壁后，貼壁生長的細(xì)胞由圓形細(xì)胞逐漸向梭形細(xì)胞，再逐漸變?yōu)轭悎A形及多角形細(xì)胞改變，Dil-ac-LDL細(xì)胞攝取率達(dá)95%以上，與同型分化抗原比較，培養(yǎng)的EPCs細(xì)胞表面分化抗原流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果為符合EPCs表型，提示培養(yǎng)的細(xì)胞為高純度EPCs。沿左心耳與肺動脈圓錐交界處下方2～3 mm處進(jìn)針，深度為1～2 mm，7-0尼龍線結(jié)扎左前降支，制作心肌梗死模型，結(jié)扎后結(jié)扎位點以下心肌變白，活動幅度減弱，之前位于等電位線的ST段明顯抬高，提示心肌梗死模型制作成功。

血管生成為心肌梗死后梗死心肌修復(fù)的重要指標(biāo)，有多個研究發(fā)現(xiàn)體外移植的EPCs可通過多種機(jī)制促進(jìn)梗死心肌修復(fù)，例如移植的EPCs持續(xù)分泌囊泡促進(jìn)梗死心肌血管生成[7]，通過抑制心肌梗死后炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激促進(jìn)梗死心肌修復(fù)[8-9]，而sEH可增強(qiáng)EPCs功能[5-6]，所以本研究檢測sEH抑制劑干預(yù)的EPCs移植后不同時間點小鼠梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)情況，檢測移植的EPCs對梗死心肌血管生成的影響，同時檢測sEH抑制劑t-AUCB對EPCs增強(qiáng)梗死心肌血管生成功能的促進(jìn)作用。

對0 μmol/L t-AUCB組Ⅷ因子表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，即使未干預(yù)sEH，隨著時間延長，移植的EPCs仍可促進(jìn)梗死心肌血管生成[10-12]，只是程度較小，相同時間內(nèi)血管生成數(shù)較少，給予t-AUCB干預(yù)后，EPCs促進(jìn)梗死心肌血管生成作用得到明顯增強(qiáng)[13-18]，且t-AUCB干預(yù)濃度越大，EPCs對梗死心肌血管生成促進(jìn)作用越強(qiáng)；而在注射EPCs后早期，即注射后1 d，就可觀察到梗死心肌邊緣血管生成，提示t-AUCB及EPCs在注射后早期即可發(fā)揮作用，或許在注射前的體外干預(yù)過程中，t-AUCB已明顯增強(qiáng)EPCs活性。而GW9662+t-AUCB組梗死心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子表達(dá)水平明顯下降，甚至低于1 μmol/L t-AUCB組。上述結(jié)果提示在注射EPCs后1 d，注射的EPCs即可促進(jìn)梗死心肌血管生成；給予t-AUCB后，EPCs對梗死心肌血管生成作用得到極大加強(qiáng)，一旦阻斷PPAR-γ通路，EPCs對梗死心肌血管生成作用則被大大抑制，但不能完全被抑制。

綜上所述，t-AUCB可通過減少EETs降解激活EPCs上PPAR-γ從而促進(jìn)EPCs發(fā)揮作用，且t-AUCB可呈濃度正相關(guān)發(fā)揮其對EPCs激活作用。當(dāng)阻斷PPAR-γ后，t-AUCB對EPCs的激活作用被明顯抑制，提示PPAR-γ通路在t-AUCB激活EPCs過程中發(fā)揮重要作用。但阻斷PPAR-γ通路后,t-AUCB對EPCs的激活作用尚未被完全阻斷，提示除了PPAR-γ通路外，t-AUCB可通過其他通路激活EPCs，從而發(fā)揮其在心血管領(lǐng)域中的作用。