超微血流成像技術對兔腹主動脈斑塊易損性的研究*

王子龍,楊莉紅,楊寒凝,陸永萍△

(1.大理大學臨床醫學院，云南大理 671000；2.云南省第二人民醫院，昆明 650021)

動脈粥樣硬化是心腦血管系統中最常見的疾病之一，易損斑塊對人體的危害性極大，且趨于年輕化。本研究擬用超微血流成像技術對兔腹主動脈斑塊易損性進行研究，以更好、更早地預防動脈粥樣硬化所致的急性心腦血管疾病的發生，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性新西蘭大白兔60只，兔齡5周，體重(624±207)g。

1.2 方法

1.2.1腹主動脈斑塊模型的制備

高脂喂養實驗兔12周后行內膜的球囊損傷術：經耳緣靜脈緩慢注射4%的戊巴比妥鈉(1 mL/kg)進行全身麻醉，于股動脈投影段切開皮膚，分離后結扎遠心端，見圖1。股動脈近心端血流被提起的手術絲線阻斷；穿刺針以25°刺入股動脈，放入導絲，退出穿刺針后沿導絲送入成人橈動脈穿刺用鞘管，并在超聲引導下立即推入6F Fogarty球囊鞘管至腹腔干水平，注入空氣至2～4個大氣壓，回拉有阻力感即可，重復推拉5次以致腹主動脈內膜損傷。操作結束后用生理鹽水清洗并用青霉素粉涂抹創口預防感染。經耳緣靜脈推注劑量250 mg/kg的牛血清清蛋白(GE，烏拉圭，SV30087.03)行免疫損傷，3 d，每天1次，繼續高脂喂養8周。

1.2.2超聲檢查

選用東芝公司Aplio 500超聲診斷儀,11-4L線陣探頭，頻率4～11 MHz。于20周末麻醉實驗兔，在腹主動脈投影位置橫縱切交叉掃描，觀察有無斑塊形成，發現目標斑塊后記錄斑塊相應特征。

1.2.3超微血流成像檢查

找到目標斑塊后，開啟超微血流成像模式，選擇合適的深度和增益，觀察斑塊內有無點、線狀超微血流聲像及個數，選擇血流最豐富區域，固定探頭，連續觀察不少于30 s，確認血流信號無誤后，詳細記錄并存圖。根據血流強度分級，標準如下[1-2]，0級：斑塊內無血流信號；1級：斑塊內顯示1～3個點狀血流信號；2級：斑塊內顯示3個以上點狀和(或)1～2處短線狀血流信號；3級:斑塊內顯示2處以上線狀且貫穿或大部貫穿的血流信號，或有血液流動征。以上操作由1名中級醫師進行，斑塊血流分級的統計分析匯總由2名高級醫師完成。選取超微血流顯像顯示血流信號最豐富的切面，運用Adobe Photoshop CS5圖像分析軟件，計算整個斑塊及內部的彩色血流信號面積，并計算彩色像素密度(MCD)[3]，即血流信號面積與斑塊總面積之比(此斑塊的MCD為圖2B與2C的像素之和與2A像素比值)，見圖2。根據MCD的數值來計算超微血流增強評分值，如MCD為1%，則超微血流增強評分值為1分，MCD為2%，則超微血流增強評分值為2分，以此類推，MCD為100%，則超微血流增強評分值為100分。

A：股動脈分離操作；B：已分離出的股動脈，結扎遠心端，近心端黑色絲線為阻斷血流做準備(黃色箭頭)。

A：斑塊總面積；B、C：2個血流信號面積。

1.2.4病理檢查

處死實驗兔，分離并切開腹主動脈，找出與超聲圖像對應的斑塊，用4%的甲醛溶液固定,行石蠟包埋，以5 μm厚度切取最大切面切片，行抗CD34抗體免疫組織化學染色。病理分型：依據文獻[4-5]方法將斑塊分為Ⅰ～Ⅵ共6種類型，Ⅰ型：巨噬細胞和泡沫細胞的沉積；Ⅱ型：脂質在斑塊內積聚到顯現脂肪點或條紋的點；Ⅲ型：細胞外脂質沉積；Ⅳ型：細胞外脂質變得致密并且更廣泛地形成脂質核；Ⅴ型：纖維結締組織形成部分斑塊(有或沒有脂質核)，在脂質核心周圍，毛細血管增生和炎性反應增加，包括淋巴細胞和巨噬細胞，出現微血腫；Ⅵ型：破裂的斑塊，特征在于斑塊內的出血和原位血栓形成，可導致栓塞或血管閉塞，暫不納入研究。Ⅰ～Ⅲ型被認為是穩定斑塊，即穩定組；Ⅳ～Ⅵ型被認為是易損斑塊，即易損組。微血管密度為200倍顯微鏡視野下每個視野內CD34免疫組織化學檢測呈陽性的血管數。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兔腹主動脈斑塊生長情況及斑塊病理類型

存活的52只實驗兔共檢出61個斑塊，其中Ⅰ型15個，Ⅱ型18個，Ⅲ型11個，Ⅳ型9個，Ⅴ型8個。

2.2 超微血流成像技術對各個病理分型斑塊的評價

2.2.161個兔腹主動脈斑塊的超微血流成像結果

61個斑塊中，超微血流顯像顯示41個有不同強度血流信號，20個無血流信號。易損斑塊血流信號明顯，可見多個點狀甚至線狀血流信號；穩定斑塊血流信號不明顯，無血流信號或僅可見1～2個點狀血流信號。超微血流成像技術檢測不同病理分型的斑塊，結果顯示病理分型與超微血流強度之間呈正相關(rs=0.735，P<0.05)，見表1、圖3。

表1 超微血流成像技術對不同病理分型斑塊的評價結果(n)

雙向等級資料，應用秩相關檢驗，相關系數rs=0.735。

A：Ⅴ型斑塊的長線狀血流信號；B：Ⅰ型斑塊的無明顯血流信號。

2.2.2兔腹主動脈斑塊超微血流增強評分值與斑塊內微血管數的比較

與穩定組比較，易損組超微血流增強評分值更高，微血管數更多，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。超微血流增強評分值與斑塊內微血管數存在正相關性(rs=0.751，P<0.05)，見圖4、5。

表2 兩組超微血流增強評分值與斑塊內微血管數比較

續表2 兩組超微血流增強評分值與斑塊內微血管數比較

2.3 超微血流成像技術檢測斑塊的ROC曲線

將超微血流成像技術對斑塊的評分值繪制受試者工作特征(ROC)曲線，結果顯示曲線下面積為0.962，靈敏度為82.3%，特異度為95.4%，診斷易損斑塊的最佳分值界點為11.5分，見圖6。

A：Ⅰ型斑塊，其內微血管數較少(黃色箭頭)；B：Ⅴ型斑塊，其內可見較多的微血管(黃色箭頭)。

圖5 斑塊超微血流增強評分值與斑塊內微血管數相關性

圖6 超微血流成像技術檢測斑塊的ROC曲線

3 討 論

動脈粥樣斑塊的形成大多數與心腦血管疾病密切相關，斑塊的易損性直接影響了臨床的治療方案和有效性，而斑塊內新生血管是斑塊易損性的標志[6-8]，故掌握斑塊內新生血管情況對預測和預防心腦血管疾病的發生有著十分重要的意義。目前能夠檢測斑塊內新生血管的技術除了超聲造影，還有CT血管造影、磁共振血管成像等，但由于費用昂貴，可重復性差，部分為有創檢查，且禁忌證多，難以在臨床全面推廣。

超微血流成像技術應用了自適應圖像處理的基本原理，將圖像逐像素處理，以分析血流及組織圖像的信息，對微血流和組織微小運動產生的頻譜信號的混雜分布區域的差異進行濾波處理[9]。通過自適應算法能提取微小血管中的低速血流信號，分辨率較普通彩色多普勒超聲高，無需注射造影劑即可過濾干擾信號,從而達到類似造影的極低流速微小血管顯像效果[10-11]。何廣敏等[3]研究表明，MCD對血流的靈敏度、特異度和準確度均高于超微血流分級，是一種可靠的定量診斷方法。

本實驗結果得出，斑塊內微血管數與超微血流增強評分值、病理分型均呈正相關，說明血流增強評分值越高的斑塊微血管數越多，血供越豐富，對應的病理分型越高，斑塊越不穩定，與薛莉等[12]研究結論有較高的一致性，即易損斑塊的發生、發展與斑塊內微血管數的形成密不可分。

超微血流成像技術檢測頸動脈斑塊的新生血管與超聲造影有良好的一致性[13-15]。研究表明，超微血流成像技術與超聲造影檢查評價斑塊內血流情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)[16]。ROC曲線結果顯示，超微血流成像技術靈敏度與特異度均較高，同時還具備誤診率低、簡單易行、可重復性好、檢查費用低等優點，彌補了超聲造影檢查的不足。魏小雨等[17]證明了超微血流成像技術是頸動脈斑塊內新生血管低速血流安全有效的檢測方法，對斑塊穩定性的評估具有重要意義，相對超聲造影檢查，某種程度上可以取而代之。

本研究的局限性為樣本量較小，且動物實驗結果仍不能完全代表人群的結果。此外，超微血流成像技術的應用處于初級階段，對超聲診斷醫師及超聲設備的要求較高，容易出現誤差等。

綜上所述，超微血流成像技術可以在二維超聲的基礎上對不同病理分型的斑塊內新生血管做出精確判斷，有望在臨床中推廣應用，為臨床預防和診治動脈粥樣硬化所致心腦血管疾病提供了強有力的影像學依據。