柚皮素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用*

王 歡，李家富，蘭 卓，徐 楠，程曉洪，馮 健

(西南醫科大學附屬醫院心內科，四川瀘州 646000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是心血管疾病引發死亡的主要原因之一[1]，隨著再灌注技術應用于臨床后，其相關的死亡率明顯下降，但缺血心肌恢復灌注時，其組織損傷反而進行性加重，從而產生一種為心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷的現象。即使如此，冠狀動脈的盡早開放仍是急性心肌梗死的主要治療手段，因此改善I/R尤為重要。已有大量研究證明氧化應激在I/R中扮演著重要的角色[2]，而磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)通路是保護I/R分子機制中的經典信號通路，可通過上調核因子E相關因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)增加內源性抗氧化作用[3]。柚皮素又名4,5,7-三羥基黃烷酮，屬二氫黃酮類化合物，大量存在于柑橘類水果中，既往心血管研究中發現其有減輕糖尿病心肌損傷[4]、抗動脈粥樣硬化[5]作用。除此之外，國內外研究中均發現柚皮素預處理對I/R有明顯保護作用，其作用機制與抗氧化應激相關[6-7]，但對其抗氧化應激分子機制的研究較少，本實驗通過建立大鼠心臟I/R模型，探討柚皮素對心肌I/R損傷的保護作用及是否通過作用于PI3K/AKT/Nrf2信號通道達到抗氧化應激作用，為柚皮素的臨床應用提供理論及實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

健康成年雄性SD大鼠32只，超級清潔級，重量180～200 g，購自湖北省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(鄂)2020-0018。適宜條件下飼養于西南醫科大學動物房。

1.1.2試劑與儀器

柚皮素及PI3K/AKT通道抑制劑LY294002購自上海阿拉丁試劑有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、肌酸激酶(creatine kinase，CK)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；AKT、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-AKT)抗體購自美國CST公司；Nrf2、醌氧化還原酶1[NAD(P)H:Quinone oxidoreductase 1，NQO1]抗體購自英國Abcam公司；血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)抗體購自武漢三鷹公司；電化學發光(ECL)檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自武漢阿斯本生物技術公司。電泳儀(北京市六一儀器廠)；掃描儀(日本Canon公司)；超凈工作臺(中國蘇凈安泰公司)；酶標儀(中國DIatek公司)；臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；冷凍離心機(湖南湘儀實驗儀器)；PCR儀(杭州博日科技公司)；熒光定量PCR儀(美國Life technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組

采用隨機數字表法將32只大鼠分為假手術組(SHAM組)、I/R組、柚皮素組、柚皮素+LY294002(NL組)，每組8只。柚皮素組及NL組腹腔注射100 mg/kg柚皮素，每天1次，連續7 d，NL組在結扎冠狀動脈前30 min腹腔注射0.3 mg/kg LY294002，SHAM組及I/R組腹腔注射對應劑量的生理鹽水。

1.2.2模型建立

參照文獻[8]，將大鼠饑餓處理12 h后，予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定并氣管插管呼吸機正壓通氣、連接心電圖。在胸骨左緣第4肋間打開胸腔并暴露心臟，于左心耳根部下方2 mm處結扎左冠狀動脈前降支(SHAM組不結扎)，結扎30 min，再灌注120 min。結扎冠狀動脈后，心肌組織蒼白、發紺，心電圖顯示ST段抬高，再灌注后缺血區心肌紅潤，心電圖ST段下移1/2以上，表示造模成功。

1.2.3大鼠心肌酶測定

I/R結束后，收集各組大鼠靜脈血，離心后的上清液按照LDH、CK ELISA試劑盒說明，采用酶標儀檢測LDH、CK水平。

1.2.4心肌組織病理學觀察

將各組大鼠的心肌組織用4%多聚甲醛固定24 h后，進行脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木素-伊紅(HE)染色，然后封片，在顯微鏡下觀察心肌組織病理形態學變化。

1.2.5TUNEL熒光染色觀察心肌細胞凋亡情況

選各組石蠟切片脫蠟、孵育、破膜、孵育、脫色，取適量TUNEL試劑盒內試劑按說明書中比例覆蓋組織，并進行孵育、洗片，最后滴加抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6心肌組織SOD、MDA水平檢測

將各組心臟組織采用酶分解法分離，然后分別采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7化學熒光法檢測心肌組織ROS水平

取各組大鼠心肌組織，稱取重量，加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，冰浴條件下勻漿，然后離心，收取上清液，留部分上清液進行蛋白定量檢測，部分加入配置好的DCFH-DA和PBS混合液，然后使用酶標儀進行檢測。

1.2.8Western blot檢測心肌組織AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平

取各組大鼠心臟組織依次經過提取總蛋白溶液、測定樣品蛋白濃度、分離和濃縮制膠、上樣、電泳轉膜處理后，加入按比例稀釋好的一抗AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH 4 ℃過夜，用TBST洗3次，加入稀釋液稀釋好的二抗，室溫孵育、搖床，加入新鮮配制的ECL混合溶液，暗室中曝光。將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標帶的吸光度值。

1.2.9逆轉錄PCR(RT-PCR)技術檢測Nrf2、HO-1基因的轉錄水平

取心臟組織，充分研磨，勻漿液中加入三氯甲烷，充分混勻，冰上靜置5 min，混合液離心，吸取上清液加入等體積4 ℃預冷的異丙醇，顛倒混勻，—20 ℃靜置15 min，再次離心，留置沉淀，加入4 ℃預冷的75%乙醇混勻，清洗RNA沉淀，再次離心，倒掉液體，乙醇充分揮發后加入RNase-Free水，充分溶解RNA。在冰上配置逆轉錄反應液，GAPDH上游引物序列5′-GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC-3′，下游引物序列5′-GTG GAT GCA GGG ATG ATG TTC-3′；Nrf2上游引物序列5′-CAA CTG GAT GAA GAG ACC GGA G-3′，下游引物序列5′-TAT GCT GCT TAA ATC AGT CAT GGC-3′；HO-1上游引物序列5′-GTG ACA GAA GAG GCT AAG ACC G-3′，下游引物序列5′-GGC CAA CAC TGC ATT TAC ATG G-3′，合成第一鏈cDNA，并在PCR儀上進行RT-PCR。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中LDH、CK的水平

與SHAM組比較，I/R組及NL組血清中LDH、CK活性水平明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，柚皮素組及NL組LDH、CK活性水平明顯降低(P<0.05)；與柚皮素組比較，NL組LDH、CK活性水平明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清中LDH、CK的水平

2.2 各組大鼠心肌組織病理結果

心肌組織HE染色顯示，SHAM組心肌纖維分布均勻，細胞核結構清楚，無炎性細胞。與SHAM組比較，I/R組心肌纖維排列紊亂，心肌細胞腫脹、破裂、溶解，大量炎性細胞浸潤。與I/R組比較，柚皮素組心肌纖維排列稍整齊，心肌細胞破壞明顯減少，炎性細胞明顯減少。與柚皮素組比較，NL組心肌組織肌纖維排列紊亂較明顯，心肌細胞破壞增加，炎癥細胞浸潤更明顯，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理結果(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠心肌組織凋亡情況

正常心肌細胞核染色為藍色，凋亡細胞核染色為綠色熒光，與SHAM組比較，I/R組凋亡細胞明顯增加，凋亡率明顯升高(P<0.05)。與I/R組比較，柚皮素組凋亡細胞明顯減少，凋亡率明顯降低(P<0.05)。與柚皮素組比較，NL組凋亡細胞明顯增加，凋亡率明顯升高(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 各組大鼠心肌細胞TUNEL染色(×400)

a：P<0.05，與SHAM組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與柚皮素組比較。

2.4 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

與SHAM組比較，I/R組及NL組SOD活性降低，MDA、ROS水平升高(P<0.05)。與I/R組比較，柚皮素組及NL組SOD活性升高，MDA、ROS水平降低(P<0.05)。與柚皮素組比較，NL組SOD活性降低，MDA、ROS水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

續表2 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

2.5 各組大鼠心肌組織AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1表達水平比較

各組AKT表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與SHAM組比較，I/R組心肌組織p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平升高，差異無統計學意義(P>0.05)；與I/R組比較，柚皮素組及NL組p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平明顯升高(P<0.05)；與柚皮素組比較，NL組p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖4、5。

a：P<0.05，與SHAM組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與柚皮素組比較。

a：P<0.05，與SHAM組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與柚皮素組比較。

2.6 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1 mRNA水平比較

與SHAM組比較，I/R組心肌組織Nrf2、HO-1 mRNA水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。與I/R組比較，柚皮素組及NL組Nrf2、HO-1 mRNA水平明顯升高(P<0.05)；與柚皮素組比較，NL組Nrf2、HO-1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)，見圖6。

a：P<0.05，與SHAM組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與柚皮素組比較。

3 討 論

盡管從基礎和臨床進行了廣泛研究，心肌I/R損傷的機制仍然不完全清楚。目前主要有氧化應激損傷、鈣離子超載、心肌能量代謝障礙、內皮細胞功能障礙、中性粒細胞浸潤、細胞凋亡和線粒體損傷等幾種學說。氧化應激損傷作為大部分疾病的主要病理變化過程，亦在I/R中發揮著重要作用。近年來以飲食或藥用植物為基礎的天然化合物在疾病中的應用已成為醫學研究中的趨勢。柚皮素作為一種新型天然化合產物，在肝癌[9]、二氧化鈦引起的關節炎[10]、預防脂肪肝[11]、糖尿病心肌病[4]等研究中均表現出明顯抗氧化作用。

LDH、CK為反映心肌損傷的常見指標，ROS、MDA為氧化應激反應時的重要產物，而SOD則為對抗氧化損傷的活性物質，本實驗通過建立大鼠心肌I/R模型，檢測上述指標，觀察柚皮素對心肌I/R的抗氧化保護效應。結果顯示I/R后心肌損傷明顯加重，氧化物質水平增加，抗氧化物質活性水平降低，而柚皮素預處理后明顯減輕了上述變化。提示心肌I/R時存在氧化應激損傷，而柚皮素在一定程度上可減輕這種損傷。

在柚皮素保護心肌I/R損傷抗氧化分子機制研究中，YU等[7]發現柚皮素可通過環鳥苷酸/蛋白激酶GIα(cyclic unanosine monophosphate /protein kinase GIα，cGMP/PKGIα)信號傳導減少氧化應激和內質網(endoplasmic reticulum，ER)應激，從而預防I/R損傷。MENG等[6]發現柚皮素具有抗I/R損傷的心臟保護作用，可以通過激活細胞和線粒體膜中的三磷酸腺苷敏感鉀通道增強心肌的抗氧化能力來實現。但調節氧化應激的經典通路PI3K/AKT尚無報道。PI3K/AKT曾在不同組織表現出明顯的抗氧化作用。而有趣的是，ZHAO等[12]發現柚皮素在脂多糖誘導的急性肺損傷中通過抑制PI3K/AKT通道發揮氧化還原調節作用。ZHANG等[13]研究顯示柚皮素可通過激活PI3K/AKT通路對半乳糖誘導的小鼠衰老發揮抗氧化作用。PI3K/AKT通道在氧化還原穩態中有著獨特的作用，既可以激活ROS的產生，又能促進抗氧化物質的釋放[14]。不同組織器官氧化還原平衡點及啟動內源性抗氧化能力不同，可能導致PI3K/AKT通道在氧化與抗氧化平衡中作用方向不同。

本研究發現柚皮素預處理明顯增強了I/R后AKT的磷酸化，使用PI3K/AKT通道抑制劑LY294002后，心肌組織AKT的磷酸化被明顯抑制，柚皮素介導的心肌組織保護作用和抗氧化作用也被明顯抑制，說明柚皮素可能通過上調PI3K/AKT信號途徑減輕大鼠心肌氧化應激損傷。

眾所周知，PI3K/AKT下游有多條信號傳導通路，其中Nrf2/HO-1通路在機體抗氧化機制中有至關重要的作用[15]，曾有研究發現通過沉默Nrf2、HO-1基因能明顯地抑制ROS的清除、增加細胞的損傷[16]。YANG等[17]發現黃芪甲苷Ⅳ通過調節PI3K/AKT途徑上調Nrf2/HO-1通路抑制缺氧-復氧誘導的H9c2心肌損傷。此外，SONG等[18]發現使用PI3K抑制劑LY294002及AKT抑制劑曲西立濱能明顯降低Nrf2、HO-1蛋白的表達并發揮抗氧化和心肌保護作用。Nrf2是調節細胞氧化還原穩態的主要轉錄因子[19]。在生理情況下，Nrf2被kelch樣ECH關聯蛋白1(recombinant kelch like ECH associated protein 1，Keap1)結合并定位在細胞質中，當機體處于氧化應激狀態時，大量ROS產生，使Keap1磷酸化發生構象變化釋放Nrf2，Nrf2進入細胞核調控SOD、HO-1、NQO1等抗氧化基因表達[20]。HO-1是一種重要的抗氧化應激和組織保護酶，可分解血紅素產生具有抗氧化作用的一氧化碳和膽綠素，還可誘導多種抗氧化信號通路，從而明顯減少細胞損傷并保護器官功能[21]。作為一種多功能酶，NQO1可以還原輔酶Q10和α-生育酚，使其發揮抗氧化作用，還能直接還原超氧化物，在抗氧化機制中有一定作用[22]。本實驗提示柚皮素預處理促進了Nrf2的表達，從而促進下游HO-1、NQO1等抗氧化物質表達，而這種作用在使用LY294002后被明顯逆轉，提示柚皮素可能通過調控PI3K/AKT信號途徑而激活下游Nrf2/HO-1/NQO1通路。

綜上所述，柚皮素在一定程度上減輕了I/R引起的氧化損傷來發揮心肌保護作用，可能與調控PI3K/AKT/Nrf2信號轉導途徑有關。本研究初步探討了柚皮素在大鼠心肌I/R損傷中抗氧化應激作用的分子機制，由于PI3K/AKT通路在調控凋亡、炎癥中亦有明顯作用，在本實驗中還顯示，在柚皮素作用下，心肌凋亡率明顯下降及病理組織炎癥細胞明顯減少，但這是否與柚皮素抗炎、抗凋亡有關，仍待進一步探討。