竹節香附素A通過JAK/STAT3通路抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖和侵襲的實驗研究

樊素珍，趙書君，秦巧紅，郜翔，王寶金，李紅雨

(鄭州大學第三附屬醫院 婦科，河南 鄭州 450000)

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率次于子宮頸癌、子宮內膜癌而列居第三位，但其死亡率卻高居婦科惡性腫瘤首位[1-2]。卵巢癌發病隱匿且病情進展迅速，大多數患者確診時已是晚期，此時臨床治療困難，預后差，患者長期生存率低，對婦女生命健康造成極大威脅[3]。竹節香附為多被銀蓮花的干燥根莖，具有明顯的抗腫瘤、抗炎、解熱、鎮痛等作用，其中竹節香附素A(RA) 的抗腫瘤活性成分可抑制胃癌細胞株BGC-823 的增殖、遷移侵襲[4]，并可誘導肝癌細胞凋亡、抑制肝癌細胞血管生成，增強其化療敏感性[5]，因而RA可能對卵巢癌SKOV3 細胞增殖及侵襲具有抑制作用。JAK/STAT3 通路在多種癌癥中處于異常的高激活狀態，且與臨床的不良預后有關，因此抑制該通路激活，可直接抑制腫瘤細胞生長，增強抗腫瘤免疫功能，進而提高臨床療效[6]。另外，JAK/STAT3 通路還與化療藥物耐藥性相關，抑制其激活，可降低乳腺癌細胞的耐藥性[7]。在對胃癌的研究中發現，RA 抑制胃癌細胞BGC-823 中STAT3 信號的激活[4]，但RA 對卵巢癌SKOV3 細胞中JAK/STAT3 通路的影響目前尚不清楚，本文通過體外培養卵巢癌SKOV3 細胞，研究RA 是否通過JAK/STAT3通路抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖和侵襲。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

卵巢癌細胞SKOV3，上海賓穗生物科技有限公司，貨號：BS-C00767533；竹節香附素A(RA)，中國藥品生物制品檢定所，批號：141113；順鉑( 純度：98.5%)，上海恒斐生物科技有限公司，批號：D8810；RPMI-1640 培養基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液、PBS 緩沖液、胰蛋白酶-EDTA 消化液，美國Solarbio公司，貨號分別為：31800、11011-8611、P1400、P1022、T1300；AnnexinV/PI 凋亡檢測試劑盒，美國BD 公司，貨號：556547；兔源GAPDH 一抗、兔源Bax一抗、鼠源Bcl-2 一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗，美國Cell Singaling Technology 公司，貨號分別為：PA5-85082、PA5-11378、13-8800、A-11029、A-11034； 兔源E-cadherin、Vimentin、JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3一抗，美國Abcam 公司，貨號分別為：ab76319、ab193555、ab133666、ab138005、ab68153、ab76315；結晶紫染色液、蛋白裂解液、CK-8 試劑盒、BCA 試劑盒，上海碧云天公司，貨號分別為：C0121、P0013K、C0037、P0011 等。

1.2 主要儀器

Elx800酶標儀購自美國Bio-Rad 公司；Olympus CKX41顯微鏡購自德國Leica 公司；IBright CL 1500凝膠成像系統購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CytoFLEX流式細儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Centrifuge 5424R 低溫高速離心機購自德國Eppendorf 股份公司；Mini-PROTEAN Tetra 蛋白電泳儀、Trans-Blot Turbo 轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司等。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

向RPMI-1640 基礎培養基中加入10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素溶液，上下顛倒混勻得完全培養基，將購買的卵巢癌細胞SKOV3 解凍復蘇，以完全培養基培養重懸后，接種在25 cm2培養瓶中，置于37℃、5% CO2、95%濕度的恒溫培養箱中培養，當細胞在瓶底長至80%左右時，胰酶消化后，以1∶3 的比例傳代培養。

1.3.2 CK-8 實驗

將RA 以RPMI-1640 基礎培養基溶解后配制為濃度90 μmol/L 的儲備液備用。使用1.3.1 中的傳代細胞接種于96 孔板中，密度約為0.6×105個/mL，培養24 h 后參照文獻[8]，以0、2、4、8、16 μmol/L 濃度的RA 處理，每個濃度設置5 個孔作為重復，繼續培養12 h、24 h、48 h、72 h 后每孔加入CK-8 試劑，采用全自動酶標儀檢測450 nm 波長下各孔吸光度值，計算每個濃度的RA對SKOV3 細胞的增殖抑制率，實驗重復3 次。公式：細胞增殖抑制率(%)=(NC 組吸光度- 實驗組吸光度)/NC組吸光度×100%。

1.3.3 細胞活力檢測

取1.3.1 中的傳代細胞接種在96 孔板中，密度約為0.6×105個/mL，培養24 h 后隨機分為三組：不做任何處理(NC 組)、RA 組、順鉑組(PDD 組)，分別以16 μmol/LRA、5 μmol/LPDD[9]處 理48 h，按 照1.3.2中的方法測定各組吸光度，計算各組細胞的細胞活力，公式：細胞活力(%)= 藥物處理組吸光度/NC 組吸光度×100%，實驗重復三次。

1.3.4 細胞凋亡檢測

取1.3.1 中的傳代細胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理48 h 后收集各組細胞，以PBS 重懸后計數，取約含有1×106個細胞的細胞懸液至做好組別標記的無菌EP 管中，轉速1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，以PBS 溶液漂洗細胞沉淀2 次，加 入500 μL Binding Buffer、10 μL AnnexinV-FITC 及5 μL PI 后，輕輕吹打細胞使之充分混勻，室溫，避光反應15 min，轉速1 000r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，細胞沉淀以PBS 溶液漂洗2 次后以PBS 重懸，輕輕吹打成為均勻的單細胞懸液，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，以Muticycle AV 軟件分析所得數據，實驗重復三次。

1.3.5 細胞遷移侵襲檢測

取1.3.1 中傳代細胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理12 h 后收集各組細胞，以細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移力，各組細胞以完全培養基分別重懸后計數，以5×105個/mL 的密度接種于6 孔板中，使用無菌直尺做標尺，以200 μL 槍頭在6 孔板中心劃一條直線，以PBS 漂洗干凈劃痕中的細胞，繼續培養24 h，在顯微鏡隨機選取5 個視野觀察并拍照，計數遷移細胞數目，取平均值，實驗重復三次。

取1.3.1 中的傳代細胞接種在12 孔板中，參照1.3.3中的方法分組處理12 h 后收集各組細胞，以Transwell侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲力，各組細胞經無血清的RPMI-1640 基礎培養基分別重懸后計數，調整密度為5×105個/mL，Transwell 上室以基質膠包被后加入200 μL 上述細胞懸液，下室中加入完全培養基，置于37℃、5% CO2、95%濕度的恒溫培養箱中培養24 h，取出小室，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，以PBS 漂洗后加入4% 多聚甲醛固定下室細胞，以結晶紫染液染色，在顯微鏡隨機選取5 個視野觀察并拍照，計數穿膜細胞數目，取平均值，實驗重復三次。

1.3.6 免疫印跡實驗

取1.3.1 中的傳代細胞接種在12 孔板中，參照1.3.3 中的方法分組處理48 h 后收集各組細胞，加蛋白裂解液( 含有蛋白酶抑制劑) 在冰浴中裂解2 h，轉速3 000 r/min，溫度為4℃，離心20 min，取上清提取總蛋白，以BCA 試劑盒測定蛋白濃度，具體按照說明書操作，調整各組細胞樣品液使蛋白濃度相同，各組細胞分別取20 μL 做SDS-凝膠電泳，轉移蛋白至硝酸纖維膜上，用5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，以相應一抗、二抗孵育，以增強型化學發光法顯色，在凝膠成像系統中觀察蛋白條帶并拍照，采用Image Lab 軟件分析數據得出蛋白相對表達量，實驗重復三次。

1.4 統計學分析

所有數據以SPSS 24.0 軟件進行統計學分析，計數數據以n(%) 表示；計量數據以±s表示，組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RA 對SKOV3 細胞增殖的影響

RA 對SKOV3 細胞增殖有抑制作用，并隨著藥物濃度升高、藥物作用時間增長而增強，在藥物濃度為16 μmol/L，作用48、72 h 后，抑制作用不再增強，趨于穩定。48 h 與72 h 相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。結果顯示，16 μmol/L 的RA 處理SKOV3 細胞48 h 后，增殖抑制率達(56.87±6.38)%。見圖1。因此，本實驗選擇16 μmol/L 的RA 處理SKOV3 細胞48 h 來進行增殖、凋亡實驗；RA 對SKOV3 細胞增殖的抑制作用可能干擾對其遷移侵襲能力的檢測，為保證實驗結果盡量準確，選擇RA 處理SKOV3 細胞12 h 進行遷移侵襲能力的檢測。

圖1 RA 對SKOV3 細胞增殖抑制率的影響

2.2 RA 對SKOV3 細胞活力的影響

以16 μmol/L 的RA、5 μmol/L 的PDD 處 理SKOV3細胞48 h，RA 組與PDD 組細胞活力顯著低于NC組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 RA 對SKOV3 細胞活力的影響

2.3 RA 對SKOV3 細胞凋亡的影響

RA 組及PDD 組SKOV3 細胞凋亡率顯著高于NC組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3、圖4。

圖3 RA 對SKOV3 細胞凋亡的影響

圖4 RA 對SKOV3 細胞凋亡的影響

2.4 RA 對SKOV3 細胞遷移的影響

RA 組及PDD 組遷移的SKOV3 細胞數目顯著低于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖5、圖6。

圖5 RA 對SKOV3 細胞遷移的影響

圖6 RA 對SKOV3 細胞遷移的影響

2.5 RA 對SKOV3 細胞侵襲的影響

與NC 組相比，RA 組和PDD 組侵出transwell 小室的SKOV3 細胞數目明顯降低(P＜0.05)，RA 組和PDD組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖7、圖8。

圖7 RA 對SKOV3 細胞侵襲的影響

圖8 RA 對SKOV3 細胞侵襲的影響

2.6 RA 對SKOV3 細胞凋亡及EMT 相關蛋白的影響

RA 組 和PDD 組SKOV3 細胞Vimentin、Bcl-2 表達顯著低于NC 組(P＜0.05)，E-cadherin、Bax 表達顯著高于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖9。

圖9 RA 對SKOV3 細胞凋亡及EMT 相關蛋白表達的影響

2.7 RA 對SKOV3 細胞JAK/STAT3 通路相關蛋白的影響

RA組和PDD組SKOV3 細胞p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3 表達顯著低于NC 組(P＜0.05)，RA 組和PDD 組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖10。

圖10 RA 對SKOV3 細胞JAK/STAT3 通路相關蛋白表達的影響

3 討 論

卵巢癌作為婦科常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率逐漸上升，且患者也越來越趨于年輕化[10]，腫瘤細胞減滅手術后以紫杉醇聯合鉑類為主聯合化療是臨床中治療卵巢癌的標準治療方案，但因大多數患者已到腫瘤中晚期，易產生化療耐藥性，并復發轉移，治愈率及患者生存率均很低，因此尋找新的安全有效的藥物具有重要的臨床意義[11]。研究表明，中藥可通過多靶點、多環節發揮抗腫瘤作用，且毒副作用低、不易產生耐藥性，是近年來研究的熱點[12]，多被銀蓮花的干燥根莖竹節香附具有明顯的抗腫瘤效應，RA 是其主要的有效活性成分，可通過下調長鏈非編碼RNA HOTAIR 表達抑制胃癌細胞增殖[13]，還可抑制人結腸癌細胞HCT-116 增殖、遷移及侵襲，促進其凋亡[14]，但其對卵巢癌細胞SKOV3 增殖及侵襲轉移能力的影響目前尚不清楚。本文通過以RA處理體外培養的卵巢癌SKOV3 細胞對此進行研究，PDD可與細胞DNA 鏈交叉連接，殺傷細胞，具有明顯的抗腫瘤作用，是臨床上常用的廣譜抗癌藥[15]，因而本文使用PDD 作為陽性藥物，抑凋亡蛋白Bcl-2 與促凋亡蛋白Bax 是細胞凋亡過程中起到重要調節作用的關鍵蛋白[16]，結果顯示，RA 組與PDD 組SKOV3 細胞活力、Bcl-2 表達顯著低于NC 組，凋亡率、Bax 表達顯著高于NC 組，RA 組和PDD 組相比，各指標無明顯變化，表明RA 可抑制SKOV3 細胞增殖，促進其凋亡；上皮細胞向間質細胞的轉化過程(EMT) 是腫瘤細胞向機體別處遷移侵襲的關鍵步驟，在此過程中，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達下調，間質細胞標志蛋白Vimentin 表達上調[17]，SKOV3 細胞經RA 及PDD 處理后，其侵襲遷移能力、Vimentin 表達明顯降低，E-cadherin 表達明顯增加，RA組和PDD 組相比，各指標無明顯變化，表明RA 可降低SKOV3 細胞遷移侵襲力。

JAK/STAT3 信號通路對腫瘤增殖、凋亡、腫瘤免疫具有重要的調節作用，卵巢癌組織中JAK/STAT3 信號處于激活狀態，并促進癌細胞增殖、誘導癌組織中免疫抑制分子PD-L1 的表達，促使卵巢癌細胞免疫逃逸[18]，而陳悅群[19]等發現，RA 可通過抑制JAK/STAT3 信號通路而抑制人子宮內膜癌HEC-1-B 細胞的侵襲轉移，因而可推測抑制JAK/STAT3 信號激活可能是RA 抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖和侵襲的作用機制，本文研究結果顯示，SKOV3 細胞經RA 及PDD 處理后，細胞p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3 明顯降低，RA 組和PDD 組相比，無明顯變化，表明RA 可抑制卵巢癌SKOV3 細胞JAK/STAT3信號磷酸化激活，揭示RA 抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖和侵襲的作用機制可能是下調JAK/STAT3 信號。

綜上所述，RA 可抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖、體外侵襲轉移，促進其凋亡，為臨床治療卵巢癌提供了新的參考，抑制JAK/STAT3 信號磷酸化激活可能是其作用機制，但本文并未使用JAK/STAT3 通路抑制劑及激活劑對其進行NC 驗證，還存在不足，起確切的分子機制需要進一步的深入研究。