自噬和PI3K/PKB通路在七氟烷麻醉結腸癌手術患者神經認知紊亂中的作用研究

孫帥，吳曉順

（鄭州人民醫院，河南 鄭州 450003）

結腸癌在老年患者中發病率較高，目前主要通過手術進行治療。為了減輕手術過程中患者的痛苦，患者一般都需要使用麻醉劑，但全身麻醉后會導致患者的認知能力下降，并引起免疫功能障礙和其他不良反應，進而降低患者的生活質量并影響其預后。目前，七氟烷在臨床常用于麻醉。小鼠體內和體外研究已顯示，七氟烷對細胞凋亡、內質網應激、突觸形成障礙、線粒體功能障礙和神經炎癥影響，這些作用可能會對老鼠出現認知障礙并產生影響［1］。然而七氟醚對神經認知損害的潛在機制仍然大部分未知。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信號通路在生理條件下對細胞生長、增殖和存活起著至關重要的作用，有文獻顯示，PI3K/PKB信號通路與神經保護作用密切相關，其能夠通過調控PI3K/PKB 信號通路，抑制炎癥、細胞凋亡和氧化應激，改善神經發生和認知能力［2］。自噬是一種分解代謝過程，其中錯誤折疊或聚集的蛋白質、脂質和細胞器被吞噬在雙膜囊泡中，以平衡其在細胞中的合成。處在壓力下，細胞死亡具有立即/壞死細胞死亡和延遲/凋亡細胞死亡兩種潛在途徑。近年來已有證據表明，自噬的上調可以預防神經退行性變［3］。而且已有動物實驗證明，自噬可以在七氟醚暴露下降解錯誤折疊的蛋白質并改善凋亡，改善神經退行性衰老大鼠的認知障礙［4］。多種分子和信號通路在調節細胞自噬中起著至關重要的作用，例如自噬相關基因家族和PI3K/PKB 信號通路。

已有研究表明，七氟烷對術后認知功能的保護具有積極作用［5］，但是關于七氟烷是否通過PI3K-Akt 通路和自噬影響結腸癌手術患者認知功能的研究較少。本研究重點探討七氟烷麻醉結腸癌手術患者自噬和PI3K/PKB 通路的變化及其與患者認知功能的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2019 年1 月在鄭州人民醫院接受腹腔鏡下結腸癌根治術治療的100 例老年結腸癌患者作為研究對象，并隨機分為SEV 組（麻醉通過七氟醚）和ISO 組（麻醉通過異氟烷），每組50 例。ISO 組男性31 例，女性19 例；年齡65～79 歲，平均（70.48±6.28）歲；TNM 分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期29 例；合并疾病類型：高血壓15 例；糖尿病16 例；高血脂18 例；吸煙史31例；飲酒史35 例。SEV 組男性31 例，女性19例；年 齡65～79 歲，平 均（70.48±6.28）歲。TNM 分期：Ⅰ期24 例，Ⅱ期26 例；合并疾病類型：高血壓17 例，糖尿病14 例，高血脂19 例，吸煙史33 例，飲酒史32 例。納入標準：①符合《中國結直腸癌診療規范》中結腸癌診斷標準；②早期單發病灶；③符合美國麻醉醫師協會分級Ⅰ～Ⅱ級；④自愿簽署知情同意書。排除標準：①接受過化療或免疫治療；②合并內分泌疾病或免疫性疾病；③合并其他惡性腫瘤或精神性疾病或語言交流障礙。本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

手術前半小時，所有患者肌肉注射阿托品0.3 mg。監測血液動力學指標，包括心率、收縮期血壓、舒張壓和脈搏氧飽和度。若發現任何異常，立即終止麻醉。靜脈注射咪達唑侖（0.05 mg/kg）、維庫溴銨（0.1 mg/kg）、丙泊酚（1.0 mg/kg）和瑞芬太尼（2 μg/kg）進行麻醉誘導，在此期間密切觀察對患者的麻醉效果。此外，患者通過氣管插管進行機械通氣，并設定相關參數：在正常情況下，呼吸頻率設為12 次/min，機械通氣潮氣量約為8 mL/kg，呼氣二氧化碳分壓為35～40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），吸氣/呼氣比約為0.5。SEV組使用七氟醚維持麻醉，ISO 組使用異氟烷維持麻醉。設定最低肺泡濃度，手術結束后終止麻醉。

1.2.1 樣本采集 收集患者手術前、手術后1 d 血液4 mL，抗凝處理后，其中2 mL 以3 000 r/min 離心8 min，取上清液，剩余血液采用RIPA 裂解液提取蛋白。

1.2.2 Western blotting 法檢測LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表達水平 血液標本經RIPA 裂解緩沖液冰上處理15 min。以12 000 g 離心10 min 后收集上清液，并通過BCA 試劑盒測定蛋白質濃度。蛋白質樣品經過13.5% 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶封閉2 h 后，將膜與LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的一抗在4°C 下孵育過夜。將膜用帶有Tween 20 的Tris 緩沖鹽水洗滌，并在室溫下與辣根過氧化物酶結合的二抗孵育2 h。使用ECL Plus 蛋白質印跡檢測系統（美國Perkin Elmer 公司）對條帶進行可視化，并在C-DiGit 印跡掃描儀上顯影膜。使用Image Studio 1.1 版本軟件進行量化。

1.3 觀察指標

①比較兩組手術前、手術后1 d 的血清PI3K和PKB 表達水平；②比較兩組簡易智力狀態檢查（MMSE）量表評分：MMSE 評分用于評估患者的認知能力。術后MMSE 評分比術前MMSE 評分降低2 分或更多，被認為是認知功能障礙。③比較兩組不良反應數量：認知功能障礙、低血壓和心動過緩。低血壓標準為收縮壓<90 mmHg。竇性心室心動過緩標準是心率<每分鐘55 次。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，相關性分析用Pearson 相關分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組術前和術后1 d 血清PI3K 和PKB 表達水平比較

兩組術后1 d 血清PI3K 和PKB 表達水平較術前增加，差異有統計學意義（P<0.05）。SEV 組術后1 d 血清PI3K 和PKB 表達水平較ISO 組降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組術前和術后1 d 血清PI3K 和PKB 表達水平比較（n=50,,pg/L）

表1 兩組術前和術后1 d 血清PI3K 和PKB 表達水平比較（n=50,,pg/L）

2.2 兩組術前和術后1 d 血液LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ表達水平比較

兩組術后1 d 血液LC3 Ⅱ表達水平較術前降低，差異有統計學意義（P<0.05）。SEV 組術后1 d血液LC3 Ⅱ表達水平較ISO 組增加，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1 和表2。

圖1 兩組LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ表達水平

表2 兩組術前和術后1 d 血液LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表達水平比較（n=50,）

表2 兩組術前和術后1 d 血液LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表達水平比較（n=50,）

2.3 兩組術前和術后1 d 的MMSE 評分比較

兩組術后1 d 的MMSE 評分較術前降低，差異有統計學意義（P<0.05）。SEV 組術后1 d 的MMSE 評分較ISO 組增加，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 兩組術前和術后1 d 的MMSE 評分比較（n=50,,分）

表3 兩組術前和術后1 d 的MMSE 評分比較（n=50,,分）

2.4 兩組術后不良反應率比較

SEV 組術后1 d 發生認知功能障礙發生率低于ISO 組，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組術后低血壓、心動過緩發生率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 兩組術后不良反應發生情況 ［n=50,n(%)］

2.5 MMSE 評分與PI3K 和PKB 表達水平及與LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ水平的相關性分析

經Pearson 相關性分析，結果顯示MMSE 評分與PI3K 和PKB 表達水平呈負相關關系（r=-0.412和-0.398，均P<0.001），而與LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平呈正相關關系（r=0.452 和0.427，均P<0.001）。

3 討論

老年患者手術后常發生認知障礙，術后認知障礙的機制相對復雜，其涉及麻醉刺激、手術創傷和其他因素。一旦發生認知障礙，患者會出現記憶力減退和言語障礙等癥狀，并導致患者住院時間延長，嚴重影響患者的預后。七氟醚吸入麻醉是手術麻醉的重要方法，具有獨特的鎮靜和鎮痛作用，且不會引起呼吸抑制，對術后具有穩定的血液動力學和神經保護作用，并能夠促進神經功能的恢復。已有研究顯示，PI3K/PKB 信號通路和自噬在麻醉藥物所導致的神經元損傷中起著重要作用［6-7］。

PI3K/PKB 信號通路不僅在細胞增殖和凋亡中起著關鍵作用，而且在調節人體的炎癥反應中也起著重要作用。有研究顯示，抑制PI3K/PKB/GSK-3β信號通路的激活可以有效改善神經性疼痛大鼠的病情和認知障礙［8］，而七氟烷可以改善大鼠反復受到麻醉刺激引起的神經認知損害［9］。本研究結果顯示，兩組術前PI3K 和PKB 水平比較無差異，兩組術后1 d 血清PI3K 和PKB 水平較術前增加。SEV 組術后1 d 血清PI3K 和PKB 水平低于ISO組，比較有差異，提示七氟烷可有效降低患者血清中PI3K 和PKB 水平，七氟烷參與了PI3K/PKB通路在患者中的作用。有研究表明，七氟烷后處理可以通過PI3K/PKB/eNOS 和PI3K/PKB/GSK-3β通路對新生大鼠的缺氧、缺血性腦損傷產生神經保護作用［10］。

自噬是細胞中功能障礙的細胞器或聚集蛋白更新的降解途徑，作為對細胞凋亡的防御反應，自噬被激活以維持細胞穩態并通過阻斷細胞凋亡途徑促進細胞存活。近年來已有證據表明，自噬的上調可以預防神經退行性變。因此，自噬的調節可能是某些神經退行性疾病（如阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病）的一種新的治療策略［11］。已有研究顯示，暴露在七氟烷下的老年大鼠在麻醉誘導的應激可能會改變海馬水平和認知功能［12］。本研究中，兩組術前LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平比較無差異；兩組術后1 d 的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平低于手術前，且SEV 組術后1 d 的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平高于ISO 組，比較有差異，提示七氟烷可有效增加患者LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平。PI3K/PKB 通路與細胞生長、分化和存活有關，PI3K/PKB 通路激活原則上將損傷神經元并抑制自噬；與此相反，自噬的誘導（mTOR 的抑制）可能會由于持續自噬去除損傷的神經細胞。本研究中，SEV 組術后1 d 血清PI3K和PKB 水平低于ISO 組，LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平明顯高于對照組，說明七氟烷可能通過抑制PI3K/PKB通路，促進神經細胞自噬，改善神經功能。

本研究結果還顯示，SEV 組認知功能障礙數量明顯低于ISO 組，而ISO 組MMSE 評分顯著低于SEV 組，表明七氟烷在提高MMSE 評分、減少認知功能障礙和減少術后不良反應有積極作用。相關分析結果表明，MMSE 評分與PI3K 和PKB 的表達水平呈負相關關系，而LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平呈正相關關系，說明七氟烷可以降低血清PI3K 和PKB，上調LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平，從而改善MMSE評分。

綜上所述，七氟烷可以通過PI3K/PKB 信號通路調節神經細胞自噬，改善結腸癌手術患者術后的認知功能，其可以為臨床應用提供參考。