銀杏黃酮降低口腔潰瘍復發率的相關免疫學分析

張軼涵，張浩然，李婉亭，馬文博

（齊齊哈爾醫學院 黑龍江，齊齊哈爾 161099）

在口腔黏膜疾病中，復發性阿弗他潰瘍（recurrent aphthous ulcer,RAU）作為常見的發病率高的潰瘍類疾病，其容易反復發作，使患者深受困擾。該發病機制尚不明確，目前多數認為因口腔潰瘍免疫功能異常、致病因素與遺傳基因、細菌病毒感染、過敏、微量元素缺乏、系統性疾病與激素失調、情緒壓力等因素相關，但確切因素尚不明確。近年來RAU 的發生和復發普遍認為其因免疫功能異常引起。當前RAU 與T 細胞免疫等作為國內外學者研究的熱點，已經證實RAU 與T細胞免疫方面具有一定的關聯性。

銀杏葉提取物對于人體脾細胞抗體具有促進生成作用，并能通過調整CD4+/CD8+T 細胞亞群比值提高小鼠免疫功能。本實驗主要研究從銀杏提取物—銀杏黃酮對于RAU 大鼠外周血T 淋巴細胞亞群的影響，其不僅可以進一步證明銀杏提取物—銀杏黃酮對于免疫功能增強的作用，還可以憑此降低口腔潰瘍的復發率，減少患者對于RAU 反復發作所帶來的痛苦。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選取體重為180～220 g 的SPF 級SD 大鼠50 只、雌雄參半，由遼寧省實驗動物資源中心遼寧長生生物技術股份有限公司提供，分籠飼養，室溫22℃～25℃，允許適當進食。

1.1.2 主要藥物和試劑 24% 銀杏葉提取物—銀杏黃酮（批號：SQYX20150415）購自西安圣青生物科技有限公司，五氟尿嘧啶購自合肥巴斯夫生物科技有限公司，左旋咪唑購自廣東華南藥業集團有限公司，10%水合氯醛購自美國WABCAN 公司，FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8 單克隆抗體均購自Thermo-Fisher Scientific-CN 有限公司，紅細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，PBS 緩沖液購自江蘇凱吉生物科技有限公司，EDTA 購自廣州邦標醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將50 只SD 大鼠適應性喂養1 周后按隨機數字表法分為空白組、模型組、陽性對照左旋咪唑組、低劑量銀杏黃酮組［5 mg/（2 mL·d）］、高劑量銀杏黃酮組［20 mg/（2 mL·d）］，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠進行口腔潰瘍模型制造，通過觀察傷口直徑，判斷造模成功與否。

1.2.2 潰瘍模型制備 使用化學灼燒法進行潰瘍模型制備：適應性飼養后，在造模前2 天和造模當天分別注射5-氟尿嘧啶（劑量50 mg/kg）。造模當天給大鼠腹腔注射10%水合氯醛，按0、3 mL/100 g劑量麻醉，使用止血鉗將大鼠上下頜撐開、固定。將直徑5～10 mm 的氫氧化鈉晶體準確放置于右側頰黏膜處，維持接觸5～10 s，以口腔頰部黏膜潰瘍出血為造模完成。48 h 后形成口腔潰瘍模型，本模型可維持7～14 d。見圖1、2。

圖1 大鼠造模后口腔潰瘍面積

圖2 銀杏黃酮高劑量治療4 d 后口腔潰瘍面積

1.2.3 藥物干預 銀杏黃酮低高劑量組組別分別按照5 mg/（2ml·d）、20 mg/（2 mL·d）每日1 次灌胃，左旋咪唑陽性對照組按照2 mg/（2ml·d）每日1 次灌胃。常組和模型組每日1 次分別使用等體積生理鹽水1 次/d 灌胃，共計灌胃14 d。實驗動物自由飲水，給予適當飲食，每日測量黏膜潰瘍面直徑1 次。

1.2.4 標本采集 連續給藥兩周，末次給藥后進行腹主動脈采血，采取2 mL 血液置于EDTA 抗凝管。各組取抗凝管內保存的血液100 μL 置于離心管內，分別依次滴加FITC-CD3、APC-CD4 和PE-CD8單克隆抗體10 μL，20 min 后滴加紅細胞裂解液1.5 mL 裂解紅細胞，避光孵育10 min 后以1 200 r/min離心5 min。取沉淀經PBS 充分沖洗滴加PBS 500 μL重懸細胞，用流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞水平，并計算CD4+/CD8+比值（用流式細胞術測定外周血T 淋巴細胞亞群）。用ELISA 檢測血清白細胞介素-2（IL-2）水平。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（-x±s）表示，比較用方差分析，組間比較用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠IL-2 水平與潰瘍愈合天數比較

各組大鼠IL-2 水平與潰瘍愈合天數比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠IL-2 水平與潰瘍愈合天數比較（n=10,）

表1 各組大鼠IL-2 水平與潰瘍愈合天數比較（n=10,）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠外周血T 淋巴細胞亞群水平比較

各組大鼠外周血T 淋巴細胞亞群水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠外周血T 淋巴細胞亞群水平比較（n=10,）

表2 各組大鼠外周血T 淋巴細胞亞群水平比較（n=10,）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

3 討論

輕型RAU 是一種周期性、復發性、自限性疾病，其發病因素并非單一因素所致，而是由復雜的、動態的及多種因素共同作用導致。李瑞澤等［1］認為，細菌病毒感染、微量元素缺乏、過敏、系統性疾病和激素失調、情緒壓力及局部因素等原因均是可以引發口腔潰瘍的明顯癥狀。目前被更多學者們普遍接受的觀點是在RAU 中免疫因素有著十分強大的作用。目前認為在RAU 的發病過程中，不管是細胞免疫功能低下還是細胞因子水平紊亂，其都對RAU 的發生、發展起到重要影響。對于細胞免疫來說，T 淋巴細胞總值（CD3+）及其亞群（CD4+、CD8+）的相對比例決定了在面對RAU 疾病時，其免疫功能發揮的作用。有文獻已經表明，RAU 患者均為細胞免疫低下狀態，且以CD4+指標低下為主［2］。

白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等均是調節機體免疫功能的重要細胞因子。在RAU 患者外周血中，尤其發現IL-2 水平較健康人明顯下降，其導致了患者免疫功能的異常，進而為口腔潰瘍致病菌群提供了機會［3］。在T 淋巴細胞中，CD4所分泌的IL-2 具有促進細胞增殖的作用［4］，通過增強T 細胞的活性從而加速自身清除炎癥的速度，全面促進潰瘍愈合［5］。

由于RAU 的復發率可高達50%，目前認為終止復發>1 年即可表示輕型RAU 痊愈。目前為止，無徹底根治RAU 的特效方法。傳統的具有消炎止痛作用的口腔黏膜貼劑、氯己定含漱液等方法無法延長該病的發病間期。銀杏黃酮作為口腔潰瘍免疫方向的研究熱點之一，多種現象表明研究可從減少復發率的角度入手。降低復發率可以有效控制口腔潰瘍的再次發生，減少患者的疼痛不適感。銀杏黃酮作為近年來所發現的一種調節免疫的藥物，有文獻已經表明，其可以增強IL-2 的分泌作用，進而提高人體免疫力［6］。還有就是給患者應用銀杏黃酮一段時間后，患者外周血的T 淋巴細胞亞群CD3+CD4+比值明顯升高，從而證明銀杏黃酮有增強細胞免疫的功能。

綜上所述，本研究以銀杏黃酮作為主要藥物、以大鼠外周血T 淋巴細胞亞群免疫細胞CD4+/CD8+比值作為主要指標對銀杏黃酮治療口腔潰瘍的效果進行實驗研究，得出結論就是銀杏黃酮可使大鼠T 淋巴細胞中CD4+/CD8+比值升高，且使IL-2水平升高，說明銀杏黃酮可使機體特異性免疫功能增強。因此證明銀杏黃酮對治療口腔潰瘍有明顯療效，其可減少口腔黏膜潰瘍面積和潰瘍愈合時間，提高機體的免疫功能，進而減少RAU 復發率。所以銀杏黃酮在治療口腔潰瘍、減少復發率、減輕癥狀等方面存在重大研究價值與潛能。目前對口腔潰瘍的治療研究依然有限，還需要更高質量的臨床研究驗證其作用；另外在免疫抑制人群中更應當注意銀杏黃酮的謹慎使用，避免其不良反應的發生［7］。