乳腺癌組織中CXCL8、CXCR1、CXCR2表達在新輔助化療前后的變化及意義

王文濤，孔濱

1青島大學附屬醫院乳腺外科，山東青島266000；2棗莊市婦幼保健院乳腺外科

新輔助化療（NAC）目前已廣泛應用于乳腺癌的治療，對于局部晚期乳腺癌患者，通過NAC能夠在早期觀察瘤體對化療方案的敏感性進而評估療效。研究顯示，CXCL8對乳腺癌的發生發展具有促進作用，CXCL8通過細胞外結合兩種G蛋白偶聯受體CXCR1和CXCR2來傳導信號，三者共同在乳腺癌微環境中表達，促進腫瘤生長和轉移［1-2］。有學者認為，CXCL8表達升高可能導致乳腺癌細胞的多重耐藥［3］。本研究觀察了NAC前后乳腺癌組織中CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達變化，探討CXCL8-CXCR1/2軸在評估乳腺癌化療療效及預后中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2016年1月—2018年12月在青島大學附屬醫院接受NAC的62例女性乳腺癌患者，發病年齡34～66歲、中位發病年齡50歲，已絕經31例、未絕經31例。行乳腺腫塊空心針穿刺活檢確診為浸潤性乳腺癌，TNM分期Ⅰ期5例、Ⅱ期30例、Ⅲ期27例。Luminal型46例，HER-2陽性型8例，三陰型8例。

1.2 治療方法NAC方案選擇以下兩種之一：①TAC×6方 案：多 西 他 賽75 mg/m2，多 柔 比 星50 mg/m2，環磷酰胺500 mg/m2，21 d為1周期，共6周期。②AC×4-T×4方案：多柔比星60 mg/m2，環磷酰胺600 mg/m2，應用4周期；序貫多西他賽80～100 mg/m2，應用4周期，21 d為1周期。化療結束后2～3周行乳腺癌改良根治術或乳腺癌保乳術。

1.3 乳腺癌組織CXCL8、CXCR1、CXCR2表達檢測方法采用免疫組化法。收集NAC前的穿刺活檢腫瘤組織和NAC后的手術切除腫瘤組織，石蠟包埋、切片，常規脫蠟至水，EDTA抗原修復，BSA封閉30 min。滴加一抗（CXCL8稀釋比例1∶100，CXCR1、CXCR2稀釋比例1∶50），4℃孵育過夜。滴加相應的二抗，37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染，脫水封固，顯微鏡下觀察。每張切片隨機取5個視野，由2名資深病理醫師采用雙盲法對染色結果進行半定量評分。CXCL8表達判定：細胞質呈黃色或褐色且染色細胞≥10%為陽性，染色細胞<10%或無染色為陰性。CXCR1和CXCR2表達判定：先進行染色強度評分，無染色為0分，淺黃色為1分，黃褐色為2分，棕褐色為3分；然后對陽性細胞百分比進行評分，<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。兩項積分相加，2～4分為低表達，5～7分為高表達。

1.4 NAC療效評估方法取NAC后的手術切除腫瘤組織，應用Miller-Payne系統進行療效評估。G1：浸潤性癌細胞無變化或個別癌細胞有所改變，但癌細胞數量總體無減少；G2：浸潤性癌細胞數量輕度減少，減少比例<30%；G3：浸潤性癌細胞數量減少比例為30%～90%；G4：浸潤性癌細胞減少比例>90%，殘留量極少；G5：原瘤床無浸潤性癌細胞，但導管原位癌可殘存。

1.5 預后隨訪方法通過查詢電子病歷系統、電話溝通等方式進行隨訪，記錄患者的無病生存期（DFS），即從手術之日起至腫瘤出現復發、轉移或其他原因導致死亡的時間。截止日期為2021年3月。

2 結果

2.1 NAC前后乳腺組織中CXCL8、CXCR1、CXCR2表達比較NAC前后CXCL8陽性率分別為27.4%（17/62）、41.9%（26/62），NAC后CXCL8陽性率升高（P<0.05）。NAC前后CXCR1表達積分分別為（5.6±1.1）、（4.8±1.4）分，CXCR2表達積分分別為（5.6±1.1）、（4.6±1.4）分，NAC后CXCR1、CXCR2表達積分均降低（P均<0.01）。

2.2 NAC前后乳腺癌組織中不同CXCL8、CXCR1、CXCR2表達水平患者的NAC療效比較NAC前CXCL8、CXCR1、CXCR2表達與Miller-Payne分級均無明顯相關（P均>0.05）。NAC后CXCL8陰性患者Miller-Payne分級G4～G5級比例高于G1～G3級患者，CXCR1、CXCR2低表達患者Miller-Payne分級G4～G5級的比例高于高表達患者（P<0.05或<0.01）。見表1。

表1 NAC前后乳腺癌組織中不同CXCL8、CXCR1、CXCR2表達水平患者NAC療效比較［例（%）］

2.3 影響乳腺癌患者NAC療效的Logistic回歸分析結果單因素分析顯示，腫瘤T分期、CXCL8（NAC后）、CXCR1（NAC后）與Miller-Payne分級相關（P均<0.05）。多因素分析顯示，腫瘤T分期、CXCR1（NAC后）是Miller-Payne分級的影響因素（OR=0.128，95%CI為0.018～0.920，P=0.041；OR=0.069，95%CI為0.008～0.590，P=0.015）。見表2。

表2 影響乳腺癌患者NAC后Miller-Payne分級的Logistic回歸分析結果

2.4 乳腺癌組織中CXCL8、CXCR1、CXCR2不同表達水平患者的DFS比較CXCL8（NAC前）陽性、陰性患者的DFS分別為24.2、44.9個月，CXCL8（NAC后）陽性、陰性患者的DFS分別為26.4、48.3個月；NAC前后CXCL8陽性患者的DFS均較CXCL8陰性患者縮短（P均<0.01）。隨訪期間NAC前CXCR1、CXCR2低表達組均未出現腫瘤復發轉移，未能計算DFS。CXCR1（NAC后）高表達、低表達患者的DFS分別為32.9、47.3個月。CXCR2（NAC后）高表達、低表達患者的DFS分別為31.2、47.5個月；NAC前CXCR1、CXCR2高表達與低表達患者的DFS比較差異無統計學意義（P均>0.05），NAC后CXCR1、CXCR2低表達患者的DFS較高表達患者增加（P均<0.01）。

2.5 影響乳腺癌患者DFS相關因素的COX回歸分析結果單因素分析顯示，腫瘤T分期、N分期、HER-2、CXCL8（NAC前）、CXCL8（NAC后）、CXCR1（NAC后）、CXCR2（NAC后）與DFS相關。多因素分析顯示，腫瘤T分期、CXCL8（NAC后）是DFS的獨立影 響 因 素（P=0.048，HR=2.620；P=0.004，HR=26.990）。見表3。

3 討論

研究表明，趨化因子和趨化因子受體與乳腺癌的耐藥性和免疫力密切相關。乳腺癌細胞既能夠產生趨化因子，也可以表達趨化因子受體，這些配體和受體在乳腺癌的進展中發揮重要作用。基于網絡的基因表達譜分析提示，CXCL8在乳腺癌中的作用顯著［4］。SINGH等［5］研究認為，CXCL8-CXCR1/2軸可能通過調節癌癥干細胞增殖和自我更新在腫瘤進展和轉移中發揮重要作用。CXCL8對接細胞膜上的G蛋白偶聯受體CXCR1和CXCR2傳導信號，CXCR1和CXCR2在所有乳腺癌細胞中均有表達，二者具有76%的序列同源性，并以相似的親和力與CXCL8結合。CXCL8及其受體CXCR1、CXCR2促進腫瘤進展的作用已有諸多文獻報道，腫瘤較大且轉移風險較高的患者，其血清CXCL8水平顯著升高［6］。乳腺癌的晚期腫瘤負荷可能會引起血清CXCL8水平升高，并導致乳腺癌的不良結局，同時CXCL8升高也與早期癌灶遠處轉移有關［7］。CXCL8表達水平增加可能有助于乳腺癌細胞的多藥耐藥，在胰腺癌裸鼠模型中移植Miapaca-2細胞后，給予吉西他濱治療，結果顯示吉西他濱可誘導CXCL8升高，進而促進新血管形成產生耐藥［8］。本研究結果顯示，NAC后CXCL8陽 性 率 升 高，CXCR1、CXCR2表 達 降 低。CXCL8陽性表達升高符合化療引起的炎癥刺激作用，CXCL8-CXCR1/2軸的激活和調節主要基于炎癥反應和免疫細胞募集［9］，導致腫瘤細胞周圍的免疫細胞產生CXCL8增多。CXCR1、CXCR2表達于乳腺組織中，隨著化療導致的腫瘤細胞凋亡、腫瘤細胞數減少，CXCR1、CXCR2表達亦降低。提示NAC可能誘導細胞因子CXCL8增多，改變乳腺癌腫瘤微環境，有利于化療耐藥的產生。

研究顯示，乳腺癌組織中CXCR1在NAC后的下降幅度與化療療效相關［5］，提示CXCR1與乳腺癌化療效果有密切聯系。CXCR2及其配體有維持化療耐藥性的作用，在化療環境中靶向CXCR2信號傳導將有助于規避化療耐藥［10］。本研究中，NAC前CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達差異與Miller-Payne分級未顯示出相關性，不排除由于患者數量偏少、臨床分期和分子分型不同等因素影響可能。然而NAC后CXCL8陽性和CXCR1、CXCR2高表達患者的Miller-Payne分級較低，化療療效較差，而CXCL8陰性和CXCR1、CXCR2低表達患者的化療療效更好；CXCR1在NAC后 的 表 達 是Miller-Payne分 級的獨立影響因素。提示NAC后CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達與化療療效相關，NAC后CXCL8、CXCR1、CXCR2可用于評估NAC療效。

既往研究顯示，血清CXCL8與激素依賴型乳腺癌［6］、HER2陽性乳腺癌［11］患者的預后不良有關。雌激素受體陰性的乳腺癌組織中CXCL8 mRNA水平升高［12］，提示預后不良。胡紫葉等［13］報道，乳腺癌組織中CXCL8表達陽性患者的預后較差。加權基因聯合表達網絡分析發現，CXCL8可能與腫瘤相關成纖維細胞的化學耐藥性相關，并與乳腺癌的預后不良相關［14］。宿主和癌細胞衍生的CXCR2信號通路在乳腺癌骨轉移中表現出非常重要的作用，CXCR2有助于乳腺癌誘導的骨溶解和骨轉移，是預后不良的重要因素之一［15］。本研究顯示，NAC后CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達與DFS相關，CXCL8陰性及CXCR1、CXCR2低表達的DFS更佳；CXCL8在NAC后的表達狀態是DFS的獨立影響因素，CXCL8陽性患者預后不良，提示CXCL8可作為預測乳腺癌患者預后的參考指標。CXCL8、CXCR1、CXCR2在NAC后的高表達提示預后不良，推測經NAC后局部病灶及全身血液中CXCL8的增多可能有利于身體遠處微轉移灶的形成和進展，進而影響患者的預后；抑制或阻斷CXCL8-CXCR1/2信號傳導可能有助于抑制腫瘤的生長和轉移，提高NAC療效，改善患者預后。

此外，本研究中NAC前的CXCL8表達與化療療效無關，而與DFS相關；分析患者資料發現，NAC前CXCL8陰性患者占73%，其中CXCR1/2高表達者占80%，這可能由于CXCR1/2高表達通過其他信號通路（非CXCL8-CXCR1/2通路）導致腫瘤耐藥，進而影響NAC療效，表現為CXCL8陰性卻耐藥的現象；而化療后這些NAC前CXCL8陰性且CXCR1/2高表達的患者轉變為CXCL8陰性且CXCR1/2低表達的患者增多，從而影響了DFS，表現為CXCL8陰性患者的DFS更佳。

綜上所述，NAC后乳腺癌組織中的CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達在評估化療療效和預后中有重要作用，可作為標志物篩選出化療療效不佳和預后不良的患者，利于指導治療決策的變更。綜合生物信息學分析提示，CXCL8是乳腺癌患者精準治療的潛在靶點［16］，靶向CXCL8-CXCR1/2軸的免疫治療可能為乳腺癌的治療提供廣闊的前景。由于本研究樣本量較小，有個別指標雖然在單因素分析時顯示有統計學意義，但在多因素分析時通過對變量因素的篩選，未能顯示統計學意義，遂未能納入多因素分析，我們將在后續研究中擴大樣本量進一步深入分析。