干擾CASC9表達對結直腸癌細胞增殖、凋亡的影響及其與miR-195-5p/CCND1軸的關系

梁峰，張瑋，王勝杰，黃曉夢，岳磊，武雪亮

1河北北方學院附屬第一醫院普通外科，河北張家口075000；2河北北方學院附屬第一醫院小兒外科；3河北北方學院附屬第一醫院醫務處

結直腸癌（CRC）是常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升和年輕化趨勢。盡管結直腸癌的診斷與治療已經取得了顯著進步，但其療效及預后仍不容樂觀。深入研究結直腸癌的發病機制有助于探索結直腸癌分子分型，為結直腸癌的治療提供新的靶點，實現結直腸癌的個體化治療。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指長度大于200 nt的非編碼RNA，廣泛參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等多種生物學過程。癌癥易感性候選基因9（CASC9）是具有致癌作用的lncRNA，在肝癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中高度表達［1-2］。miR-195-5p是新發現的腫瘤相關miRNA，可通過抑制靶基因的表達發揮抑癌作用［3］。研究發現，lncRNA除了直接參與基因的表達調控外，也可作為一種競爭性內源RNA與miRNA相互調控，共同參與靶基因的表達，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用［4］。細胞周期蛋白D1（CCND1）是細胞周期蛋白家族中高度保守的成員之一，CCND1功能失調引起細胞異常增殖，與多種腫瘤的進展密切相關。CCND1和miRNA在癌癥中的靶向關系已有報道，LIU等［5］研究發現，miR-138通過靶向CCND1抑制食管癌的生長和腫瘤發生；CAI等［6］研究發現，miR-186在肺腺癌中可以直接靶向CCND1、CDK2和CDK6。然而，CASC9、CCND1以及miR-195-5p/CCND1軸 在結直腸癌腫瘤發生發展中作用的相關研究較少。2020年6月—2021年6月，我們通過干擾結直腸癌細胞中CASC9的表達，觀察其對細胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制與miR-195-5p/CCND1軸的關系，為結直腸癌的診斷和治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器人正常結腸黏膜上皮細胞系NCM460和結直腸癌細胞系SW480、SW620、HCT-116均購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。RPMI1640培養液、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京索萊寶生物有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒試劑購自美國Invitrogen公司；細胞計數試劑盒CCK-8購自上海碧云天生物科技有限公司。雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司。靶向CASC9的shRNA載 體、miR-195-5p mimics、miR-195-5p antagomir（anti-miR-195-5p）以及對應的陰性對照載體、所需引物購自廣州市銳博生物科技有限公司。流式細胞儀購于美國貝克曼庫爾特公司，實時熒光定量PCR儀購于美國賽默飛公司。

1.2 細胞培養取NCM460、SW480、SW620、HCT-116細胞，常規培養于含10%FBS的RPMI1640培養基中，置于37℃、5% CO2恒溫箱中培養。當細胞融合密度達到80%左右，加入0.25%胰蛋白酶消化，進行細胞傳代處理，每2～3 d傳代1次。

1.3 高表達CASC9結直腸癌細胞的篩選采用實時熒光定量PCR法檢測四種細胞中的CASC9表達。取對數生長期細胞，加入TRIzol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以1μL cDNA為模板，按照RTqPCR試劑盒說明書的步驟，進行RT-qPCR擴增。反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，PCR For?ward Primer 0.4 μL，PCR Reverse Primer 0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。引物序列見表1。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，68℃延伸45 s，共40個循環。產物經瓊脂電泳，以Labworks 4.5圖像分析系統進行分析。以GAPDH為內參，計算CASC9的相對表達量。取CASC9表達與正常結腸黏膜上皮細胞差異最明顯的結直腸癌細胞用于后續實驗。

表1 CASC9基因及內參GAPDH引物序列

1.4 高表達CASC9結直腸癌細胞分組與轉染取表達CASC9最高的結直腸癌細胞，隨機分為CASC9干擾組和干擾對照組。將細胞接種于6孔板中，待細胞生長至密度達到70%時，采用LipofectamineTM2000試劑分別將shRNA-CASC9轉染至CASC9干擾組、sh-NC轉染至干擾對照組。轉染后6 h后更換新鮮培養基，繼續培養72 h。

1.5 高表達CASC9結直腸癌細胞增殖能力觀察采用CCK-8法。取兩組對數期生長細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，用RPMI1640培養液制成單細胞懸液。調整細胞密度為2.5×104/mL，以200 μL/孔接種于96孔培養板內，觀察細胞貼壁且生長良好，并設調零對照孔，每組各設6個復孔。選取492 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值。以培養時間為橫軸，OD值為縱軸，繪制細胞生長曲線。每組重復3次取平均值，另設單孔只加培養基作為空白對照。細胞增殖活力（%）=（實驗組OD值－空白對照組OD值）/空白對照組OD值×100%。

1.6 高表達CASC9結直腸癌細胞凋亡檢測采用流式細胞術。將兩組轉染后的細胞繼續培養48 h，加入胰酶消化，離心。加入雙蒸水1∶4稀釋的結合緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為（2～5）×105/mL。取195 μL細胞懸液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC混勻，室溫反應10 min，PBS洗滌，再以190μL稀釋的結合緩沖液重懸，加入PI染色，上流式細胞儀分析。每樣本收集20 000個細胞熒光信號，采用Cellquest軟件分析結果。

1.7 高表達CASC9結直腸癌細胞miR-195-5p、CCND1 mRNA表達檢測取兩組細胞，采用實時熒光 定 量PCR法 檢測miR-195-5p、CCND1 mRNA表達。具體操作步驟參照“1.3”，擴增引物序列見表2。

表2 miR-195-5p基因及內參GAPDH引物序列

1.8 CASC9與miR-195-5p/CCND1軸的靶向關系的預測及驗證使用StarBase數據庫預測CASC9與miR-195-5p、miR-195-5p與CCND1的潛在結合位點，采用雙熒光素酶報告基因檢測法進行驗證。構建野生型和突變型基因靶點CASC9的3'UTR-熒光素酶表達載體WT-CASC9和MUT-CASC9。取結直腸癌細胞接種到24孔板上，培養24 h，待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000分別將miR-195-5p mimics、miR-NC與野生型和突變型載體共轉染，分為miR-NC組、miR-195-5p mimics組。使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定，以熒光素酶活性和Renilla活性的比值計算實驗結果。實驗重復3次取平均值。

1.9 統計學方法采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高表達CASC9結直腸癌細胞篩選結果結直腸癌細胞與正常結腸黏膜上皮細胞CASC9表達比較NCM460、SW480、SW620、HCT-116細胞中CASC9的 相 對 表 達 量 分 別 為0.340±0.043、1.333±0.053、0.740±0.043、0.976±0.073。與NCM460細胞相比，SW480、SW620、HCT-116細胞中CASC9表達均升高（P均<0.01），其中SW480細胞高于其他細胞，故將SW480細胞用于后續實驗。

2.2 兩組SW480細胞增殖能力比較轉染后48 h及72 h，CASC9干擾組的增殖能力均低于干擾對照組（P均<0.01）。見表3。

表3 兩組SW480細胞增殖能力比較（±s）

表3 兩組SW480細胞增殖能力比較（±s）

組別CASC9干擾組干擾對照組t P細胞活力（OD450）24 h 0.312±0.011 0.324±0.013 0.695 0.176 48 h 0.624±0.029 0.974±0.054 5.707 0.002 72 h 0.905±0.039 1.363±0.025 9.895<0.001

2.3 兩組SW480細胞凋亡率比較CASC9干擾組和干擾對照組的細胞凋亡率分別為21.52%±0.35%、9.40%±0.21%。與干擾對照組相比，CASC9干擾組細胞凋亡率升高（P<0.01）。

2.4兩組SW480細胞miR-195-5p、CCND1 mRNA表達比較與干擾對照組比較，CASC9干擾組SW480細 胞 中miR-195-5p表 達 增 加（P<0.01），CCND1 mRNA表達降低（P<0.01）。見表4。

表4 兩組SW480細胞miR-195-5p、CCND1 mRNA表達比較（±s）

表4 兩組SW480細胞miR-195-5p、CCND1 mRNA表達比較（±s）

組別CASC9干擾組干擾對照組t P miR-195-5p 1.67±0.14 1.05±0.09 6.450 0.003 CCND1 mRNA 0.44±0.05 1.02±0.08 10.652<0.001

2.5 CASC9與miR-195-5p/CCND1軸的靶向關系預測結果通過Star Base v3.0數據庫預測到CASC9 mRNA與miR-195-5p存在結合位點，CASC9可靶向吸附miR-195-5p，見圖1；CCND1 mRNA是miR-130a-3p的下游靶蛋白，miR-195-5p可與CCND1 mRNA特異結合，見圖2。

圖1 生物信息學預測CASC9靶向miR-195-5p的結合位點

圖2 生物信息學預測miR-195-5p靶向CCND1的結合位點

2.6 CASC9與miR-195-5p/CCND1軸的靶向關系驗證結果在WT-CASC9細胞中，miR-195-5p mimic組相對熒光素酶活性較miR-NC組降低（P<0.01）；在MUT-CASC9細胞中，兩組相對熒光素酶活性比較差異無統計學意義（P>0.05）。提示CASC9能夠特異性結合miR-195-5p。見表5。

表5 雙熒光素酶報告實驗結果（±s）

表5 雙熒光素酶報告實驗結果（±s）

組別miR-NC組miR-514b-5p mimic組t P WT-CASC9 0.97±0.11 0.35±0.05 8.891<0.001 MUT-CASC9 1.03±0.12 1.01±0.11 0.213 0.842

3 討論

最新研究發現，lncRNA CASC9具有重要的致癌作用，在乳腺癌［7］、結直腸癌［8］和膠質瘤［9］等多種癌癥中均呈高表達。WU等［10］發現，食管鱗狀細胞癌（ESCC）組織芯片顯示CASC9是lncRNA表達上調最多的基因；預后分析發現，高表達CASC9的患者具有較差的預后；另外，CASC9表達下調可明顯抑制ESCC細胞體外生長和裸鼠腫瘤發生。YANG等［11］研究發現，CASC9在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）組織和細胞系中高表達，且與患者腫瘤大小、臨床分期、區域淋巴結轉移和總生存時間密切相關；體外實驗發現，下調CASC9表達可抑制細胞增殖、細胞自噬和凋亡；其機制是CASC9通過AKT/mTOR信號通路促進細胞增殖和抑制自噬介導的細胞凋亡，進而促進OSCC的惡性進展。本研究結果顯示，與正常結腸黏膜上皮細胞比較，結直腸癌細胞SW480、SW620、HCT-116中CASC9表達均升高，表明CASC9在結直腸癌中呈高表達。其中SW480中CASC9表達最高，故用于后續實驗。

本研究結果顯示，干擾SW480細胞中的CASC9表達后，細胞增殖能力低于干擾對照組，細胞凋亡率高于干擾對照組，表明干擾CASC9表達可明顯抑制結直腸癌細胞的增殖能力并促進細胞凋亡。與siNC組相比，si-CASC9組SW480細胞中miR-195-5p表達顯著增加，CCND1 mRNA表達明顯降低。CASC9可能通過調控miR-195-5p影響下游靶基因CCND1表達進而抑制結直腸癌細胞的惡性進展。

lncRNA可以作為分子誘餌來招募相應的RNA結合蛋白或間接調控靶基因的轉錄，這種調控方式被稱為“海綿吸附效應”，具備該作用的lncRNA也被稱為競爭性內源性RNA（ceRNA）［12-13］。此類lncRNA作 為ceRNA競 爭 性 地 與miRNA結合，miRNA作為轉錄后調控的重要調節因子，其可被lncRNA通過“分子海綿”的方式吸附，從而影響下游編碼基因的蛋白質表達水平，進而參與調控腫瘤多種生物學行為［14］。研究表明，CASC9可在多種實體腫瘤中充當miRNA分子海綿吸附miRNA，進而發揮調控作用。SHAO等［15］報道，CASC9通過競爭性結合到乳腺癌細胞中的miR-195和miR-497來正向調節檢查點激酶1（CHK1），從而促進乳腺癌細胞增殖和細胞周期進程，抑制細胞凋亡。miRNA是一類內源性的非編碼單鏈小分子RNA，其能夠與mRNA互補序列結合從而引起mRNA降解或抑制翻譯過程［16］。miR-195-5p是一種新發現的腫瘤相關miRNA，有研究顯示miR-195-5p可通過靶向調節PRRR11的表達抑制前列腺癌細胞的增殖能力和管生成能力，從而發揮抑癌作用［17］。本研究通過生物信息學分析顯示，CASC9可與miR-195-5p靶向結合，CASC9可作為miR-195-5p的“分子海綿”。熒光素酶報告基因結果證實，CASC9可特異性地與miR-195-5p結合。干擾CASC9表達后，CCND1 mRNA表達顯著降低。說明CASC9可通過海綿狀吸附miR-195-5p并抑制其表達，進而促進其靶基因CCND1的表達。

綜上所述，CASC9可能通過下調miR-195-5p，促進CCND1表達上調，從而促進結直腸癌細胞的增殖能力，提示CASC9有望成為新的治療靶點和結直腸癌的潛在診斷標志物。