E-cadherin表達和TSHR甲基化在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價值及意義

周淑敏 宋艷芳 張麗華

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲狀腺癌常見病理類型，以淋巴結轉移為主要特點，通常女性發(fā)病率遠遠高于男性[1]。近年來，該腫瘤發(fā)病率逐漸增加，雖然隨著影像學技術的發(fā)展，其臨床診斷準確率得到保證，但是該腫瘤的生存率未得到顯著改善。相關研究顯示：患者年齡<45歲、腫瘤最大徑>1 cm、多灶病變可導致PTC中央區(qū)淋巴結轉移的風險增加[2-3]。因此甲狀腺乳頭狀癌相關靶基因的篩查對該癌癥的診斷意義重大。研究顯示：在PTC的低風險和高風險組中，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達存在差異，高風險組織學變種的侵襲行為與細胞質E-鈣粘著蛋白的表達增加有關[4-5]。另外也有研究顯示：PTC組織中TSHR基因啟動子區(qū)常出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，并且與頸部淋巴結轉移、臨床分期等密切相關，可能是引起該癌癥發(fā)展及轉移的機制之一[6-7]。鑒于此，本研究前瞻性選擇162例PTC患者的癌組織及癌旁組織樣本，采用免疫組化和實時熒光定量甲基化特異性PCR(q MSP)法分別檢測患者PTC病灶組織及癌旁組織中及E-cadherin和TSHR啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，并進一步對E-cadherin表達和TSHR甲基化在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價值及意義進行分析，以期對該癌癥的診斷及發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2020年6月于周口市中心醫(yī)院進行手術的162例甲狀腺乳頭狀癌患者的癌組織標本為本次研究對象。所有PTC患者均未接受過放化療及免疫治療、無其他嚴重并發(fā)癥及惡性腫瘤且臨床資料完整。所有患者中，鱗癌89例、腺癌73例；TMN分期：Ⅰ期43例、Ⅱ期61例、Ⅲ期39例、Ⅳ期19例；頸部淋巴結轉移70例、未發(fā)生頸部淋巴結轉移92例；取65例癌旁組織標本作為對照。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化(SP法)檢測E-cadherin表達 采用免疫組化(SP法)檢測PTC癌組織及癌旁組織中E-cadherin的表達：采用鼠抗人E-cadherin單克隆抗體及免疫組織化學試劑盒(購自美國賽默飛世爾科技公司hermo Fisher Scientific)，將組織固定，然后根據(jù)石蠟切片制作流程包埋并切片，根據(jù)試劑盒說明書流程進行染色，最后DBA顯色，光學顯微鏡下觀察并拍照。采用雙盲法，由我院病理科兩位醫(yī)師按照表1對染色結果進行陽性判斷。

表1 陽性判定標準

1.2.2 甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR，MSP)法檢測TSHR甲基化[8]采用MSP法檢測PTC癌組織及癌旁組織中TSHR甲基化情況。即從癌組織及癌旁組織樣本中提取DNA，采用DNA亞硫酸氫鹽處理試劑盒(購自ZYMO RESEARCH)對DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，將已修飾的DNA作為模板，在ProFlex PCR儀(廠家：美國賽默飛世爾科技公司hermo Fisher Scientific，貨號：4484075)中利用甲基化和非甲基化特異性引物進行PCR擴增，擴增條件根據(jù)試劑盒說明進行設置和操作，然后通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.3 診斷結果計算

靈敏度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異性=真陰性數(shù)/(假陽性數(shù)+真陰性數(shù))×100%；準確性=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，所得數(shù)據(jù)資料均為計數(shù)資料，以(%)表示，組間比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 E-cadherin和TSHR在癌組織中表達及甲基化程度比較

與癌旁組織相比，癌組織組E-cadherin高表達、TSHR甲基化以及兩者聯(lián)合檢測陽性例數(shù)均顯著高于癌旁組織(P均<0.001)，見表2。

表2 各組E-cadherin和TSHR在癌組織中表達及甲基化程度比較(例，%)

2.2 E-cadherin表達和TSHR甲基化與患者主要臨床特征的相關性

E-cadherin表達和TSHR甲基化PTC患者例數(shù)在不同腫瘤直徑患者中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，頸部淋巴結轉移PTC患者E-cadherin高表達例數(shù)顯著高于低表達PTC患者，TSHR甲基化PTC患者例數(shù)顯著高于非甲基化PTC患者，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，見表3。

表3 E-cadherin表達和TSHR甲基化與患者主要臨床特征的相關性(例，%)

2.3 兩個指標對PTC診斷的靈敏度、特異性和準確性比較分析

E-cadherin高表達聯(lián)合TSHR甲基化對PTC診斷的靈敏度、特異性和準確性較單項檢測均出現(xiàn)上升趨勢，但僅靈敏度與單一檢測相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩個指標對PTC診斷的靈敏度、特異性和準確性比較分析/%

3 討論

PTC是甲狀腺癌中最常見的腫瘤類型之一，約占80%，為分化程度高且預后良好的一種類型，但是淋巴結轉移(lymph node metastasis,LNM)在PTC中較為常見且預后不良，近年來其發(fā)病率急劇增長，因此其早期診斷對癌癥的治療及生存率的提升至關重要[9-11]。相關研究提出：人類癌癥臨床結果的改善需要表征其發(fā)病機理的遺傳改變，針對PTC來說，西方人群中已揭示出多種致癌驅動因素，這對于該癌癥的致病機制的探索至關重要，而到目前為止，中國PTC患者的遺傳狀況仍未完全闡明[12]。此外，遺傳變異和臨床病理特征的綜合分析表明，激酶基因融合與PTC診斷時年齡較小，腫瘤較大和淋巴結轉移有關。此外有研究通過分析PTC中RET基因融合的DNA重排位點，PTC與RET融合事件相關的染色體易位的也有關[13]。因此近年來與PTC診斷相關的靶基因研究中涉及到多種基因的表達和甲基化檢驗：如：p16、NIS、TSHR等基因的甲基化以及標志物TGF-β1、CK19、CK19和CD31等蛋白的表達。

E-cadherin是Cadherin家族中的一員，主要分布于上皮組織中，介導細胞間的粘附功能，研究顯示其可能與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲以及其發(fā)生和進展密切相關，并對其診斷具有重要意義[4,14]。TSHR基因是甲狀腺點代謝的關鍵基因，其甲基化是PTC組織中頻發(fā)的分子事件，與腫瘤的進展相關并提示PTC患者的不良預后[8]。本研究前瞻性選擇162例甲狀腺乳頭狀癌患者的癌組織及65例癌旁組織樣本，分別采用免疫組化(SP法)和甲基化特異性PCR(MSP)法檢測E-cadherin表達情況和TSHR甲基化程度，E-cadherin表達和TSHR甲基化在PTC患者中的診斷結果顯示：癌組織組E-cadherin高表達、TSHR甲基化以及兩者聯(lián)合檢測陽性例數(shù)均顯著高于癌旁組織(P均<0.001)，表明在PTC癌組織中E-cadherin呈現(xiàn)高表達且TSHR甲基化程度增加，與前人研究結果一致[4,15]。

另外，E-cadherin表達和TSHR甲基化PTC患者例數(shù)在不同腫瘤直徑患者中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，頸部淋巴結轉移PTC患者E-cadherin高表達例數(shù)顯著高于低表達PTC患者，TSHR甲基化PTC患者例數(shù)顯著高于非甲基化PTC患者，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，表明：E-cadherin的高表達和TSHR的甲基化預示著PTC患者發(fā)生淋巴結轉移且臨床分期程度較高，從而對該癌癥的臨床診斷具有一定價值。此外，E-cadherin高表達聯(lián)合TSHR甲基化對PTC診斷的靈敏度、特異性和準確性較單項檢測均出現(xiàn)上升趨勢，但僅靈敏度與單一檢測相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明：E-cadherin表達聯(lián)合TSHR甲基化檢測在PTC的診斷中具有較高靈敏度，而在本研究中，E-cadherin高表達聯(lián)合TSHR甲基化對PTC診斷的特異性和準確性雖數(shù)值上有所增加，但是差異無統(tǒng)計學意義，這可能與本研究中納入的樣本量，尤其是癌旁組織樣本量較少有關，后續(xù)將擴大樣本量對該問題進行深入計算和分析。

綜上，E-cadherin表達和TSHR甲基化與PTC患者頸部淋巴結轉移情況以及TNM分期密切相關，且E-cadherin高表達聯(lián)合TSHR甲基化對PTC臨床診斷具有較好的靈敏度。