長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在乙肝繼發小肝癌中的表達意義

秦建增 杜世奇 張玉華

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染為臨床上比較常見的傳染性疾病，其引起的肝硬化能夠造成肝細胞的再生與肝臟的持續性炎癥，大約75%的小肝癌患者發病前伴隨有肝硬化。不過從乙肝繼發到小肝癌的周期比較長，也涉及到細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移相關的基因的異常表達[1-2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度介于200到10萬個核苷酸之間的沒有編碼功能的RNA，在早期被認為是DNA轉錄異常的產物[3]。隨著研究技術的深入，已有研究顯示lncRNA在癌組織中呈現差異性表達，其可通過吸附或調控小RNA(miRNA)來參與基因和蛋白的調控，從而可作為惡性腫瘤的診斷標志物[4]。同源異形盒基因A11反義RNA(HOMEOBOX A11 antisense RNA，HOXA11-AS)是1種與惡性腫瘤細胞周期相關的lncRNA，能反映腫瘤的分級與預測預后[5-6]，本文具體探討了lncRNA HOXA11-AS在乙肝繼發小肝癌中的表達意義，希望為臨床上進一步探索影響小肝癌發生的分子機制提供參考。現總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2017年2月到2020年5月選擇在本院接受診治的乙肝肝硬化患者268例，其中200例為單純乙肝肝硬化患者(肝硬化組)，68例為乙肝繼發小肝癌患者(小肝癌組)。納入標準：血清乙肝表面抗原(HBsAg)陽性；本院倫理委員會批準了此次研究；患者簽署了知情同意書；年齡20～75歲；都符合單純乙肝肝硬化或乙肝繼發小肝癌的診斷標準。排除標準：入院前3個月有護肝藥物使用史的患者；轉移性肝癌患者；合并有膽汁淤積性肝病、酒精性肝病、脂肪性肝病、自身免疫性肝病等患者；精神系統疾病患者；既往有任何放療、化療等患者。

1.2 lncRNA HOXA11-AS表達檢測

采用EDTA 抗凝血型管采集所有患者的血液標本2～3 ml，24 h內采用淋巴細胞分離液進行混合，3 000 rpm/min離心20 min，取血細胞。使用Tizol試劑提取總RNA，逆轉錄條件設定為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 8 min。對逆轉錄形成的cDNA濃度進行測定，對其進行稀釋溶解后用于PCR測定。PCR引物根據lncRNA HOXA11-AS在NCBI中的序列通過NCBI primer進行分析，PCR反應條件：95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循環40次，以U2作為內標，計算lncRNA HOXA11-AS相對表達水平。

1.3 調查資料

調查2組患者的性別、年齡、體重指數、AFP、ALT、AST值等指標，記錄小肝癌組患者的腫瘤最大直徑、臨床分期、遠端轉移、腫瘤包膜、組織學分化等指標。

1.4 統計方法

本研究采用SPSS19.00統計軟件對數據進行統計學分析，采用均數±標準差表示計量數據(對比為t檢驗)，采用%、率等表示計數數據(對比為卡方χ2分析)，采用單因素和Cox多因素分析數據資料，P<0.05時差異在統計學上具有意義。

2 結果

2.1 一般資料對比

2組的性別、年齡、體重指數、AFP、ALT、AST值對比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料對比

2.2 lncRNA HOXA11-AS相對表達水平對比

小肝癌組的lncRNA HOXA11-AS相對表達水平(21.48±1.38)顯著高于肝硬化組(2.09±0.14)(t=78.922，P<0.001)。

2.3 不同病理特征與lncRNA HOXA11-AS表達水平的相關性

在小肝癌組中，lncRNA HOXA11-AS相對表達水平與腫瘤最大直徑、臨床分期、遠端轉移、腫瘤包膜、組織學分化存在相關性(P<0.05)。見表2。

表2 乙肝繼發小肝癌患者的不同病理特征與lncRNA HOXA11-AS表達水平的相關性

2.4 影響因素分析

在小肝癌組中，以lncRNA HOXA11-AS相對表達水平作為因變量，以腫瘤最大直徑、臨床分期、遠端轉移、腫瘤包膜、組織學分化作為自變量，單因素和Cox多因素分析顯示臨床分期、遠端轉移、組織學分化、腫瘤包膜為影響lncRNA HOXA11-AS相對表達水平的主要因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響乙肝繼發小肝癌患者lncRNA HOXA11-AS相對表達水平的單因素與多因素分析(n=68)

3 討論

小肝癌具有發病率高、預后差、容易轉移復發等特點，但小肝癌多由乙肝肝硬化發展而來，也是多步驟、多階段的過程，其開始于肝組織受到乙肝病毒感染導致的肝硬化過程，為此早期篩查與診斷具有重要價值[7]。近年來，為了提高小肝癌的早期診斷率，已有AFP、ALT、AST等血清標志物應用于肝癌的診斷，但是診斷敏感度或特異度均不夠理想。本研究也顯示2組的性別、年齡、體重指數、AFP、ALT、AST值對比差異無統計學意義(P>0.05)，為此需要繼續在臨床上尋找與小肝癌診斷或預后評估有關的腫瘤標志物。

lncRNA在人體機制中的調控作用已經逐漸得到學術界認可和重視，lncRNA分子在許多腫瘤疾病中都參與發揮著調控作用。lncRNA在體液中的存在形式比較穩定，可以持續地被檢測到，對腫瘤細胞內的變化反應也較為靈敏。它可以通過與各蛋白分子及蛋白復合物相結合，對相鄰蛋白的編碼基因表達造成影響，發揮染色質結構的修飾、轉錄和調節作用。已有不少研究證明了lncRNA在乳腺癌、肺細胞癌、胃癌患者體內有異常表達情況，可以作為其病理診斷的臨床獨立預測因素[8-9]。同源盒(homeobox，HOX)家族基因與胚胎發育和腫瘤發生存在相關性，其也為一種高度保守的同源異形結構域。HOX包括A、B、C、D 4個簇，其中HOXA基因簇5’區域的方向涉及到正義鏈中編碼蛋白質的基因，lncRNA HOXA11-AS作為其中一種新的長鏈非編碼RNA，位于染色體7p15.2上，在神經膠質瘤、漿液性卵巢癌、上皮性卵巢癌、宮頸癌、骨肉瘤、肺癌、胃癌、結直腸癌等發揮著促癌或抑癌等作用[10-11]。本研究顯示小肝癌組的lncRNA HOXA11-AS相對表達水平高于肝硬化組(P<0.05)，表明乙肝繼發小肝癌患者多伴隨有lncRNA HOXA11-AS的高表達，lncRNA HOXA11-AS也在小肝癌中發揮著促癌作用。

隨著醫學技術的發展，多種肝癌相關的IncRNA已被鑒定，IncRNA可通過各種不同機制影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡等過程。有研究通過對PC3細胞和LNCaP細胞進行lncRNA的過表達質粒后進行增殖活性檢測，發現LNCaP細胞在過表達lncRNA之后，細胞增殖能力顯著增強，當對lncRNA表達進行敲減之后，細胞增殖能力也顯著降低[12]。有學者對肝癌細胞進行Transwell小室模擬實驗，發現肝癌細胞的遷移侵襲能力在lncRNA分子敲減之后顯著降低，證明lncRNA的表達水平與腫瘤細胞的侵襲能力相關[13]。有研究通過建立裸鼠模型進行試驗，發現過表達lncRNA的裸鼠體內肝臟發生多發轉移，證明lncRNA在肝癌細胞的惡性進展中的推動作用[14-15]。本研究顯示小肝癌患者的lncRNA HOXA11-AS相對表達水平與腫瘤最大直徑、臨床分期、遠端轉移、腫瘤包膜、組織學分化存在相關性(P<0.05);單因素和Cox多因素分析顯示臨床分期、遠端轉移、組織學分化、腫瘤包膜為影響lncRNA HOXA11-AS相對表達水平的主要因素(P<0.05)，說明小肝癌患者的病理特征與lncRNA HOXA11-AS表達水平存在相關性。

當前也有研究表明lncRNA HOXA11-AS為胃癌患者中表達顯著上調，敲低lncRNA HOXA11-AS可抑制胃癌細胞的增殖、遷徙、侵襲能力，促進細胞凋亡、阻滯細胞周期[16]。lncRNA HOXA11-AS可通過富集miR-140—5p途徑調節膠質瘤的發生，lncRNA HOXA11-AS表達水平較高的患者預后較差[17]。不過lncRNA的生物學功能在腫瘤的病程變化的同時也會發生變化，因此需要對其進行更進一步的研究，避免在治療中發生不可預料的副作用，逐漸挖掘其臨床治療價值。

總之，lncRNA HOXA11-AS在乙肝繼發小肝癌患者中呈現高表達情況，臨床分期、遠端轉移、組織學分化、腫瘤包膜與lncRNA HOXA11-AS表達存在相關性，也是影響lncRNA HOXA11-AS的主要因素。