熒光定量PCR法與免疫組織化學法檢測胃黏膜中幽門螺桿菌感染的臨床意義

王曉楠（天津市東麗區東麗醫院,天津 300300）

幽門螺桿菌（HP）屬于革蘭陰性螺旋桿菌，主要定植于胃黏膜上皮細胞表面，其感染與消化性潰瘍、胃癌等發生密切相關[1-2]。免疫組織化學法（IHC）可在組織切片技術的基礎上特異性結合抗體、抗原并通過組織化學顯色技術原理實施檢測，具有高敏感度和特異度，易于判斷陽性，是診斷HP感染的常用手段[3]。熒光定量聚合酶鏈式反應（FQ-PCR）法具有敏感度高、特異度高等特點，還能定量分析病原體核酸，逐漸被應用于微生物感染[4]。本研究分析FQ-PCR法與IHC檢測胃黏膜中HP感染的臨床意義，為臨床診斷方式選擇提供參考。詳情報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年8月-2020年12月我院接診的86例慢性胃炎患者，均采集胃黏膜活檢標本，其中女48例，男38例；年齡26-81歲，平均年齡（56.85±3.45）歲。

1.2 試劑與儀器 徠卡全自動免疫組織化學染色儀（LeicaBONDMAX型）；全自動熒光定量PCR儀（ABI7500型）；HP免疫組織化學檢測試劑盒（Dako公司）；購自北京新基永康生物科技有限公司的HP23SrRNA基因突變核酸檢測與HP分型鑒定試劑盒；購自中山大學達安基因股份有限公司的HP鑒定試劑盒；購自北京厚生博泰科技有限公司的DNA提取試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 IHC檢測HP 切取每例患者胃黏膜切片，厚度為4μm，設立陰陽性對照，使用全自動免疫組織化學染色儀染色。陽性判讀標準：鏡下胃黏膜黏液層、腺管上皮、小凹上皮、上皮表面存在著色為棕黃色的HP菌體。觀察鏡下胃黏膜黏液層、腺管上皮、小凹上皮、上皮表面HP判斷感染強度。無：未見HP；輕度感染（+）：低于標本全長1/3或偶見有少數HP；中度感染（++）：HP分布超過標本全長1/3而低于2/3，或連續性、薄而稀疏地存在于上皮表面；重度感染（+++）：HP基本分布于標本全長，成堆存在。

1.3.2 FQ-PCR檢測HP 切取每例患者石蠟組織切片10張，厚度為10μm，置入潔凈的EP管內，用毛筆刷干凈后，實施DNA提取。石蠟組織樣本內加入緩沖液GA250μL，90℃環境下孵育60min，離心后，取200μL包含組織的液體，加入至新的EP管內，滴加蛋白酶K40μL，顛倒混勻，水浴，溫度為56℃，過夜消化，待組織完全消化為準。離心處理消化后的液體，吸上清，加入新的EP管內，加入250μL緩沖液GB，震蕩混勻后，水浴10min，溫度為70℃。加入250μL無水乙醇，震蕩混勻、離心。在DNA吸附柱內加入獲取的混合液，放置1min，離心，將濾液去除。加入緩沖液GD500μL，放置1min，離心，將濾液去除。加入500μLPW，放置1min，離心，將濾液去除，重復兩次。在新的收集管內套入吸附柱，離心后開蓋，靜置2min，使乙醇揮發。加入70℃預熱后的Elution緩沖液50μL，靜置2min，需Elution緩沖液在硅基質膜的中間懸空滴加，以確保洗脫液能完全覆蓋硅基質膜。離心后獲取樣本DNA提取液。以每份TaqDNA聚合酶0.25μL、反應液22.5μL的標準分別配制分型、鑒定反應混合液，震蕩混勻后，離心，按每管樣本2.5μL、反應混合液22.5μL分裝至PCR反應管中。最后加入陰性對照與陽性對照，離心，實施PCR擴增。調整閾值線，計算閾值（Ct值）。根據試劑盒說明書計算樣本的ΔCt值，判讀感染強度。輕度感染（+）：ΔCt值＞3.00；中度感染（++）：ΔCt值為0.01-3.00；重度感染（+++）：ΔCt值為0.00-0.01。

1.3.3 23SrRNA基因突變核酸檢測 對IHC與FQ-PCR檢測結果不一致樣本實施HP23SrRNA基因突變核酸檢測。前期操作與FQPCR檢測相同，調整閾值線，計算Ct值。陽性感染：HP23S反應液1和2中存在VIC或FAM通道（23SrRNA反應液1中FAM通道、VIC通道分別為A2142G、AA野生型；反應液2中FAM通道、VIC通道分別為A2143G、AA野生型）且Ct值≤35.00。

1.4 觀察指標 ①分析IHC與FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP感染情況及其感染強度。②分析FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP分型檢測結果。

1.5 統計學方法 本次實驗研究應用SPSS21.0軟件分析數據，用（±s）表示計量資料，組間比較用t檢驗；以n（%）表示計數資料，組間比較用χ2檢驗，等級資料使用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HP感染情況 86份標本經FQ-PCR檢測陽性率為30.23%（26/86），IHC檢測陽性率為25.58%（22/86），兩者檢測HP陰性符合率為93.75%（60/64），陽性符合率為84.62%（22/26），總符合率為95.35%（82/86）。兩種檢查方式對HP陽性檢出率比較，差異無統計學意義（χ2=0.462，P=0.497）。兩種檢查方式中共有4例不一致樣本，均為FQ-PCR檢測出而IHC未檢出HP感染，對其實施HP23SrRNA基因突變核酸檢測，結果顯示均為陽性，可見存在HP感染。

2.2 HP感染強度 IHC與FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP感染強度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 HC與FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP感染強度比較[n(%)]

2.3 HP分型檢測結果 FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP陽性標本26例，其中Ⅱ型菌4例（15.38%）。

3 討論

HP感染后產生多種致病因子，對胃黏膜形成損害，誘發噯氣、反酸等癥狀，是引發胃腺癌、慢性胃炎等胃腸疾病發病的相關細菌感染[5]。HE染色、糞便HP抗原檢測、尿素呼氣試驗等均是檢測HP的常用手段，其中常規HE染色檢測具有價廉、簡便等優點，但菌體有著色差異，可能會發生染色較淺和無法與其他污染物或雜菌區分情況[6]。尿素呼氣試驗無創、操作簡便，但需口服放射性同位素，可能會影響環境、人體，且不適用于胃輕癱、胃下垂、幽門梗阻、晚期胃癌、高位梗阻、十二指腸瘀滯癥等患者[7-8]。糞便HP抗原檢測操作簡便、無需口服任何試劑且無任何不良反應，為完全非侵入性檢查，且無需昂貴儀器，但檢查結果會受到試劑貯藏條件、運輸和操作方法、操作人員技術等因素影響[9]。IHC檢測準確性較高，但檢測依賴于病理醫師鏡下觀察經驗與判讀經驗，檢查結果會受到人為主觀因素影響，且無法對HP做出分型判斷。

本研究中，兩種檢查方式對HP陽性檢出率、檢測胃黏膜標本中HP感染強度均無明顯差異；共有4例不一致樣本，均為FQPCR檢測出而IHC未檢出的HP感染，對其實施HP23SrRNA基因突變核酸檢測，結果顯示均為陽性；FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP陽性標本26例，其中Ⅱ型菌4例，提示IHC與FQ-PCR檢測HP感染具有較高的符合率。FQ-PCR檢測可靶向標記23SrRNA基因與16SrRNA基因，實行完全閉管式操作，避免擴增產物受到污染。FQ-PCR檢測還能適時定量擴增產物，使反應精確度提高，結果可靠、操作簡便，且能自動讀數，進而避免發生人為誤差[10]。FQ-PCR檢測還具有取材方便、標本易于保存、檢查耗時短等優點，適用于HP感染大規模篩查。

綜上所述，IHC與FQ-PCR檢測HP感染情況與感染強度符合率較高，FQ-PCR法還能檢測HP基因分型，可將其作為在檢測胃黏膜中HP時IHC法的替代檢測法。