竹醋液與漂白液對大腸桿菌抑菌殺菌效果對比

袁花艷,周獻峰,徐偉兵（廣東省惠州市惠陽區疾病預防控制中心,廣東 惠州 516211）

近年來含氯消毒劑的發展較快，由以前的氯氣及主要含次氯酸鈣的漂白粉，發展到現在的二氧化氯、氯化溴和氯代異氰尿酸等高效、快速、廣譜的消毒劑[1]，但漂白液依然是日常生活中常使用的消毒劑。然而含氯消毒劑也有其自身的弱點，它的殺菌性能易受到有機物及酸堿度的影響，對物品有一定的腐蝕作用，有些含氯消毒劑不夠穩定，容易分解，消毒劑還能與體系中的芳香族化合物反應生成劇毒的物質，污染環境，危害人體健康。竹醋液是20世紀末日本率先開發成功的一種純天然綠色環保產品，主要成分為水（約含80%），次要成分為有機酸類（約含7%-11%，其中醋酸約含6%）、酚類（約含6%-8%）、酮類（約含0.8%-1%）、醛類（約含0.02%-1%）、醇類（約含0.01%-1%）和一些微量成分（約含0.05%-1%），成分隨著熱解溫度、炭化設備、精制方法、儲存條件等的不同而變化[2]。在日本、韓國等國竹醋液在農林業上的研究應用已較為廣泛。據研究，竹醋液具有殺菌、殺蟲、保鮮除臭、無毒副作用等諸多優異的特性[3-5]；竹醋液在農業上可以用于調節植物的生長，促進植物的發芽[6]；在醫藥衛生和環境保護上可以作殺菌劑和抑菌劑使用[7]。但將竹醋液與其他種類的消毒劑比較研究國內外都較少，因此本研究就是通過將竹醋液作為消毒劑對大腸桿菌抑制殺滅方面的應用，以及與漂白液進行比較，根據結果為竹醋液在某些應用部分或者全部替代漂白液提供參考，以減少化學消毒劑的用量，為以后環保消毒劑的開發提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

1.1.1 實驗材料 竹醋液：由廣東自然堂生物有限公司提供，pH=2-3。漂白液：商品名：藍月亮漂白液，生產廠家：廣州藍月亮實業有限公司，凈含量為1.2kg，有效氯含量為40000mg/L，pH=12-13，生產期為2019年2月3日，有效期至2021年2月3日。標準硬水（硬度342mg/L）；胰蛋白胨生理鹽水溶液（TPS）；營養瓊脂培養基；營養肉湯培養基；胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA），實驗試劑制備以及應用參考《2008年消毒技術規范》進行[8]。大腸桿菌由惠陽疾控微生物室提供。用打孔機制備直徑為7mm的紙片，高壓后備用。

1.1.2 實驗儀器 ①不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。②電熱恒溫培養箱（湖北省黃石市恒豐醫療器械有限公司）。③電熱恒溫鼓風干燥箱（湖北省黃石市恒豐醫療器械有限公司）。④三角恒溫水箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液配制方法 吸取5.0mL稀釋液加入到第6代大腸桿菌菌種的新鮮斜面瓊脂培養基，反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0mL吸管將洗液移至另一無菌試管中，在手掌上拍打80次，以使細菌懸浮均勻。制備成實驗標準的菌懸液濃度。

1.2.2 消毒劑配制方法 分別取五體積的竹醋原液與五體積無菌水將其混合均勻，并對該稀釋液進行逐級稀釋（即二倍稀釋），稀釋成竹醋液濃度分別為50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%和1.5625%以及原液七個濃度梯度；分別取五體積漂白液與五體積無菌水將其混合均勻，并對該稀釋液進行逐級稀釋（即二倍稀釋），稀釋成漂白液濃度分別為20000mg/L、10000mg/L、5000mg/L、2500mg/L、1250mg/L和625mg/L以及原液七個濃度梯度；將竹醋液替代標準硬水，按照上述方法操作以及稀釋梯度，稀釋漂白液得到相應的六個稀釋濃度。

1.2.3 活菌培養計數技術 活菌培養計數使用平板傾注法，操作程序如下：取10支試管置于試管架上，每管加入4.5mL稀釋液。由左向右，逐管標上10-1、10-2、10-3、……、10-10 。用1.0ml試管吸取0.5mL新鮮的第六代大腸桿菌菌懸液加入10-1管內。將10-1管依前法在手掌上用力振打80次，混勻，再吸取出0.5mL加入10-2管內，如此類推，直至10-10管。

取6個平皿，由左至右，逐皿標上10-5至10-10，取出10-5至10-10菌懸液管，吸取其中混合均勻的懸液1.0mL對號加于各個無菌平皿內。每個稀釋度接種兩個平皿。將40℃-45℃熔化的培養基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15mL-20mL。將平皿蓋好，即刻輕輕搖動均勻，平放。待瓊脂凝固后，反轉平皿使底向上置37℃恒溫培養箱內培養48小時。

培養至48小時后，觀察并計算各平皿的菌落數。記錄每平板菌落數在15cfu-300cfu的稀釋度。一般含菌量約為1×108cfu/mL-5×108cfu/mL。平行三次試驗，組間誤差率不應該超過10%，計數平均結果符合標準。平板間誤差率=（板間菌落平均數/板間菌落平均數）×100%。

1.2.4 中和劑的鑒定 在細菌殺滅試驗中所用中和劑的鑒定，至少應平行進行以下各組試驗。

第1組：中和劑+菌懸液→培養

第2組：（消毒劑+中和劑）+菌液→培養

第3組：稀釋液+菌懸液→培養

第4組：稀釋液+中和劑+培養基→培養

實驗結果符合以下全部條件，所測中和劑可判為合格。

①第1、2和3組有相似量試驗菌生長，懸液試驗作用體系中菌量在50cfu/mL-300cfu/mL之間。其組間菌落數誤差率應不超過15%。第1、2和3組間菌落數誤差率計算公式如下：

②第4組無菌生長。

③試驗重復3次，每次試驗均應符合以上要求。

1.2.5 抑菌環測定 采用平板擴散法分別用移液加樣器取五個濃度梯度藥劑8ul加于7mm的圓形小濾紙片上，然后用滅菌鑷子將帶藥濾紙片（稱紙碟）放入皿內接過0.2ml含菌量為7.43×108cfu/mL的培養基上，每皿放三片（竹醋液、漂白液、對照），重復三次，各紙碟間距離要適宜，放置時要平放，迅速、準確，放下后就不能再移動，每放一片要立即蓋上皿蓋防污染，經過37℃培養箱中培養24h培養后，測定抑菌圈直徑，正確測量各菌抑菌圈直徑，精確到0.5mm。試驗重復3次。

1.2.6 最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度。取竹醋液5mL，加入裝有5mL液體培養基的試管中，搖勻后取5mL置于另一支裝有5mL液體培養基的試管中，稀釋為含有不同濃度竹醋液5mL混合液，依次類推，最后一管棄去5mL的混合液，并設對照組（一管為生長對照管，一管為空白對照管，均不含竹醋液或者漂白液），取菌懸液含菌量為7.43×108cfu/mL0.1mL接種于各試管中和生長對照管中，充分搖勻，細菌在37℃下培養24h。觀察試管澄清度，若液體培養基混濁，表示細菌生長，若液體培養基完全清亮，表示無細菌生長。無細菌生長的最小濃度為最小抑菌濃度。試驗重復3次。

1.2.7 最小殺菌濃度（MBC）的測定 最小抑菌濃度（MIC）測定實驗中，從最小抑菌濃度檢測結果的澄清液體培養基中取出0.1mL，涂布平板，細菌置37℃溫箱中培養24h，觀察有無菌落生長。無菌落生長的最小濃度為最小殺菌濃度。試驗重復3次。

1.2.8 殺菌率的測定 根據MBC的結果，每種消毒液作3個濃度梯度的配比液。取4.5mL竹醋液，加入裝有4.5mL標準硬水的試管中。搖勻后再吸取4.5ml混合液，加入另一支裝有4.5mL標準硬水的試管中，如此類推，直至最后一管。最后一管搖勻后再吸4.5mL混合液，棄去，作竹醋液稀釋液（竹醋液加標準硬水）。挑選MBC濃度及臨近的3支竹醋液與硬水的配比液，加入0.5mL含菌量為7.43×105cfu/mL菌懸液，混合搖勻并開始計時。分別于2分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘時各吸取0.5mL混合液移入相應的

裝有4.5mL中和劑的試管中混勻。中和10分鐘后吸取0.2mL移入平皿，加入TSA，搖勻，待TSA凝固后放入37℃恒溫培養箱中培養24小時，觀察細菌生長情況。用TPS稀釋液做對照組。試驗重復3次。

2 結果

2.1 菌落計數結果 符合稀釋后菌數計數在15-300的都只是稀釋到108時才符合，通過計算可以得到三組數據的誤差率為9.86%，菌落計數結果為7.43×109，見表1。

表1 大腸桿菌菌落計數（cfu/ml）

2.2 中和劑鑒定結果 漂白液第1、2、3和4組菌落計數為171、165、162和0；竹醋液第1、2、3和4組菌落計數為171、170、162和0。

根據上述的計算公式，可知分別用漂白液、竹醋液作為消毒劑時，計算出本次中和劑實驗鑒定的組間菌落數誤差率分別為2.00%和2.38%。結果均符合中和劑鑒定的要求，因此判定該中和劑合格。

2.3 抑菌環實驗結果 相同稀釋倍數的情況下漂白液的抑菌圈大于竹醋液的抑菌圈，而漂白液和竹醋液的混合液抑菌圈明顯大于前面兩個消毒劑。此外，當稀釋倍數達到1∶8時，隨著稀釋倍數的增加，竹醋液的抑菌圈大小改變不明顯。見表2。

表2 消毒劑的抑菌圈（單位為cm）

2.4 MIC測定結果 竹醋液與漂白液最低抑菌稀釋度都是1∶64，即竹醋液含量為1.5625%，漂白液的濃度為625mg/L，MIC由大到小分別為漂白液、竹醋液以及漂白液與竹醋液混合液。見表3。

表3 最小抑菌濃度結果

2.5 MBC測定結果 竹醋液的MBC為二倍稀釋到1∶16即竹醋液含量為6.25%，而漂白液是到1∶64即濃度為625mg/L，漂白液的最小殺菌濃度比竹醋液要小，而漂白液與竹醋液混合液的最小殺菌濃度比前兩者都要小。見表4。

表4 最小殺菌濃度結果

2.6 殺菌率測定結果 同等稀釋倍數的情況下，漂白液的殺菌能力要比竹醋液強，而漂白液與竹醋液混合液的殺菌能力比前兩者均要強。見表5、表6。

表5 殺菌計數結果（cfu/ml）

表6 殺菌率計算結果[n(%)]

3 討論

竹醋液可以廣泛應用于農業生產、醫療保健、食品加工、處理污水等多個領域，但在抗菌消毒方面尚有待于開發[9]。與之相比較的漂白液早已在多個領域的消毒中廣泛應用，但含氯消毒劑理化性質不穩定，易受pH、有機質和還原物質的影響，受日光的照射易分解失效，難以貯存，而且對人體健康也會造成危害。

本次實驗結果顯示在相同稀釋倍數的情況下漂白液的抑菌圈均大于竹醋液的抑菌圈，當竹醋液替代標準硬水為稀釋液時，此時抑菌圈明顯大于前面兩個消毒劑的抑菌圈。另外隨著稀釋倍數的增加，竹醋液抑菌圈大小的改變并不是特別明顯。在MIC的測定結果上竹醋液與漂白液之間的比較上并無明顯區別，最低殺菌稀釋率均為1∶64，即竹醋液含量為1.5625%，漂白液的濃度為625mg/L。而從MBC的實驗結果數據和殺菌率的結果可以看出，漂白液均要優于竹醋液，竹醋液和漂白液復配液的MBC和殺菌率又均高于漂白液和竹醋液。此次研究結果與國內的周建斌等[10]、李忠琴[11]、蔣新龍[12]研究結果一致，表明竹醋液有一定的抑菌殺菌作用。該實驗中竹醋液與漂白液的混合比例，由于時間問題并沒有廣泛開展研究，而這些問題都有待進一步的實驗探討，使得竹醋液更好地被利用。

漂白液和竹醋液都具有一定的抑菌殺菌作用[13-15]。竹醋液可以在抑菌方面替代或者部分替代漂白液使用，而且竹醋液與漂白液混合有比較明顯的增效作用，可以達到更好抑菌效果，加上竹醋液是一種天然綠色產品，對環境無污染，這為以后減少漂白劑的使用以及其他有害環境的消毒劑使用提供了參考，為新型環保消毒劑的開發利用提供了參考。