微生物胞外多糖的提取與應(yīng)用研究進(jìn)展

王蓓蓓 張偉 周曉倫

摘 要：隨著科學(xué)研究的不斷深入與提取技術(shù)的提高，近年來(lái)對(duì)多糖生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)有了量的提升和質(zhì)的飛躍，多糖的生物學(xué)功能涉及免疫、癌變、腫瘤和衰老等方面，可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、污水處理等領(lǐng)域。該文對(duì)多糖的定義、分類、生物合成和多糖的提取方法進(jìn)行了概述，重點(diǎn)闡述了高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)、超臨界流體萃取法、雙水相萃取法。雖然對(duì)微生物多糖的研究仍在不斷深入，但微生物多糖真正的應(yīng)用價(jià)值尚未得到實(shí)現(xiàn)。目前，胞外多糖已經(jīng)作為食品添加劑運(yùn)用到食品工業(yè)中，除此之外多糖還可用于制備抗腫瘤新藥或疫苗、抗凝血等應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：微生物胞外多糖;提取方法;生物合成;超臨界流體萃取法

中圖分類號(hào) Q539 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2021）18-0021-03

Research Progress on Extraction and Application of Microbial Extracellular Polysaccharides

WANG Beibei1 et al.

（1Baishui Central Health Center， Pingliang 744000， China）

Abstract： With the continuous development of scientific research and the improvement of extraction technology， researchers in recent years on the biological function of polysaccharide understanding has a quantity of improvement and qualitative leap， involving immunity， cancer， tumor and aging and other aspects， can be applied to food， medicine， agriculture， sewage treatment and other fields. This article gives a detailed overview of the definition， classification， biosynthesis and extraction methods of polysaccharides， with emphasis on high-voltage pulsed electric field technology， supercritical fluid extraction， and aqueous two-phase extraction. Although the research on microbial polysaccharides continues to deepen， the true application value of microbial polysaccharides has not been realized. At present， extracellular polysaccharides have been used as food additives in the food industry. In addition， polysaccharides can also be used to prepare new anti-tumor drugs or vaccines.

Key words： Microbial Exopolysaccharide; Extraction method; Biosynthesis; Supercritical fluid extraction

1 多糖的定義與分類

多糖（Polysaccharide）屬于典型的糖類物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)十分龐大而且復(fù)雜，是由多個(gè)單糖分子失水與縮合構(gòu)成，為典型的聚合糖高分子碳水化合物，由至少4個(gè)單糖并通過(guò)糖苷鍵進(jìn)行結(jié)合。微生物細(xì)胞外多糖，則是微生物在繁殖過(guò)程中分泌至細(xì)胞之外的多糖高分子碳水化合物，或者產(chǎn)生莢膜多糖，與微生物細(xì)胞壁粘連，或分泌游離到微生物細(xì)胞壁外形成粘液多糖[2]。

按照多糖生成物種來(lái)源，可以將多糖分為微生物、動(dòng)物與植物多糖;按照所處微生物細(xì)胞位置，可以將其微生物多糖進(jìn)一步分為細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞壁多糖。細(xì)胞外多糖又可以按照單糖的構(gòu)成模式分為同型與異型多糖[3]。

2 微生物胞外多糖的合成

微生物胞外多糖（Exopoly Saccharides，EPS）是原核細(xì)胞型生物和真核細(xì)胞型生物等在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的對(duì)其自生有保護(hù)作用的聚合物。微生物胞外多糖的生物合成受到多種因素的影響，如溫度、氫離子濃度指數(shù)、溶氧量、培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例、裝液量等。部分微生物在其成長(zhǎng)的全過(guò)程中均能分泌胞外多糖（EPS），而有些微生物只能在對(duì)數(shù)期或穩(wěn)定期才產(chǎn)生細(xì)胞外多糖。較高的碳氮比、較低培養(yǎng)溫度、營(yíng)養(yǎng)不平衡、非生物脅迫的環(huán)境條件等均有利于細(xì)胞外多糖的合成和產(chǎn)生。如微生物細(xì)胞外多糖的產(chǎn)生需要在高碳氮比，而糖原的產(chǎn)生也需要高碳氮比，因此兩者相互競(jìng)爭(zhēng)。

微生物細(xì)胞外多糖生成菌種類較為豐富，也有著頗為廣泛的分布，現(xiàn)有報(bào)道主要為：醋酸桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、酵母菌屬、雙歧桿菌等，其中部分菌株多糖結(jié)構(gòu)與表型都已經(jīng)得到明確[4]。在G+菌和G-菌中，細(xì)胞外多糖的合成過(guò)程十分復(fù)雜，包含細(xì)胞外多糖合成酶的種類，合成酶在細(xì)胞內(nèi)外的移動(dòng)和胞內(nèi)多糖與胞外多糖的轉(zhuǎn)變。細(xì)胞外多糖的合成主要分為以下幾個(gè)步驟[5]：（1）在微生物中，實(shí)行單糖活化和糖核殼體轉(zhuǎn)變;（2）通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyl Transferase）將單糖的重復(fù)單元連接在脂類載體（Wzx/Wzy）行成多糖;（3）運(yùn)輸單糖穿過(guò)管道狀脂類載體（Wzc/Wzb/Wza）;（4）多糖聚合物（EPS）分泌至細(xì)胞表面。

3 胞外多糖的提取方法

在提取發(fā)酵液中微生物胞外多糖時(shí)，要依次經(jīng)歷去除微生物菌體、多糖提取、多糖干燥等階段。去除微生物菌體采用高速離心或?yàn)V膜過(guò)濾等，多糖提取一般可以分為鹽沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法，多糖干燥是烘干胞外多中液相成分。

3.1 鹽沉淀法 鹽沉淀法是利用多糖結(jié)合化合物產(chǎn)生絮狀沉淀而析出的原理。如十六烷基吡啶（CPC）和季銨鹽十六烷基三甲基銨的溴化物（CTAB）能與酸性多糖形成不溶于水的聚合體，分離出的多糖沉淀再利用鹽溶液或有機(jī)物溶解聚合體，采用滲析等方法除去聚合體中CPC和CTAB。

3.2 有機(jī)溶劑沉淀法 有機(jī)溶劑沉淀法是水溶性多糖的常用提取方法，因?yàn)樗苄远嗵侨苡谒蝗苡谟袡C(jī)物的特質(zhì)，在水溶性多糖中加入2倍體積以上的有機(jī)物，使多糖形析出，常用的有機(jī)物有乙醇、異丙醇和丙酮。此法操作簡(jiǎn)單，能把發(fā)酵液中的大部分水溶性多糖都沉淀出來(lái)，但其中有少量的雜質(zhì)，需純化，費(fèi)用消耗較高。

3.3 高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)（Pulsed Electric Field，PEF） 由于微生物細(xì)胞膜會(huì)存在磷脂與蛋白質(zhì)，它們都攜帶一定的電荷，在10～50kV/cm2的電場(chǎng)環(huán)境中，會(huì)使得細(xì)胞膜兩側(cè)異性電荷相互吸引，進(jìn)而對(duì)膜體產(chǎn)生擠壓效應(yīng)，而攜帶電荷物質(zhì)將會(huì)向兩極迅速移動(dòng)，于是就會(huì)形成膜電穿孔效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)容物開(kāi)始被溶出。PEF技術(shù)的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在整個(gè)過(guò)程中不會(huì)生成熱量，可以對(duì)提取物進(jìn)行很好保護(hù)，不會(huì)產(chǎn)生熱降解[6-7]。張鐵華等以西藏靈菇發(fā)酵液為材料，通過(guò)高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)提取胞外多糖，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化高壓脈沖電場(chǎng)條件提取乳酸菌胞外多糖的質(zhì)量濃度比對(duì)照組的提高84.30%，且用時(shí)短、效率高[8]。張玉等以羊肚菌菌絲為研究對(duì)象，借助PEF法對(duì)其體胞中的多糖發(fā)酵液進(jìn)行提取，利用響應(yīng)面法，對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和液料比值進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳條件為：電場(chǎng)強(qiáng)度18kV/cm、脈沖數(shù)7、液料比值27mL/g，此時(shí)多糖的得率達(dá)到最大值，為56.03μg/mL[9]。

3.4 超臨界流體萃取法 超臨界流體萃取技術(shù)（SFC）是近些年得到創(chuàng)新發(fā)展的提取技術(shù)，其萃取劑為超臨界狀態(tài)下的流體，然后從固相或者液相中對(duì)其中有效構(gòu)成進(jìn)行萃取。當(dāng)前使用較為常見(jiàn)的是二氧化碳[10]。李燁等采用超臨界二氧化碳流體對(duì)灰樹(shù)花多糖進(jìn)行了提取，提取率為53.18%，并發(fā)現(xiàn)夾帶劑濃度對(duì)灰樹(shù)花多糖的超臨界CO2提取工藝有顯著性影響[11]。楊孝輝等使用這種超臨界CO2對(duì)淮山多糖進(jìn)行提取，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了萃取工藝，發(fā)現(xiàn)超臨界二氧化碳流體萃取淮山多糖萃取得率為（0.2807±0.0045）%，與預(yù)測(cè)值0.287%接近[12]。王大為等采用超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)研究其對(duì)蒙古口蘑多糖提取率的影響，結(jié)果表明，萃取率為2.06%，與溶劑處理和未處理試樣相比提取率分別為4.2倍、1.8倍[13]。目前，運(yùn)用超臨界流體萃取法提取微生物多糖還是比較少的，大多數(shù)都是用于天然植物和藥物的提取。

3.5 雙水相萃取法 雙水相體系是指雙高聚物雙水相體系，其原理是由于高聚物分子的空間阻礙作用，不能相互滲透形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下可分為二相[14]。劉琳等利用乙醇/碳酸鉀雙水相體系對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的多糖進(jìn)行萃取分離，經(jīng)過(guò)優(yōu)化條件，多糖提取率達(dá)（98.34±0.83）%。該方法能夠同步有效地分離樺褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的多糖，且其蛋白質(zhì)和菌體的去除效果好，具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景[15]。

4 微生物胞外多糖的應(yīng)用研究

在現(xiàn)代科技持續(xù)發(fā)展下，再加上不同學(xué)科的交叉融合，研究人員開(kāi)始對(duì)多糖及其復(fù)合物的生物活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。雖然微生物多糖研究日益深入，然而真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還十分鮮見(jiàn)，微生物多糖的價(jià)值并未得到很好的體現(xiàn)。如今，已經(jīng)被批準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)的細(xì)胞外多糖主要有結(jié)冷膠、黃原膠等[16]。

4.1 在食品中的應(yīng)用 如今，很多種多糖都已經(jīng)在食品加工業(yè)中得到使用，其中黃原膠的應(yīng)用更是廣泛，它為典型的乳化品、增調(diào)品等。黃原膠是基于黃單胞桿菌，并借助于發(fā)酵而生成的微生物酸性雜多糖，已經(jīng)被美國(guó)食藥管理（簡(jiǎn)稱FDA）批準(zhǔn)，并用作食品添加劑。黃原膠以其優(yōu)異、獨(dú)特的理化特性和食用安全性，可作為增稠劑、乳化劑、懸浮劑等在乳及乳制品、飲料制品、烘烤食品、糧食及糧食制品、調(diào)味品及冷凍飲品等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，以此增強(qiáng)食品的穩(wěn)定性和提高食品的品質(zhì)[17]。

4.2 在醫(yī)藥中的應(yīng)用 已報(bào)道從不同生物中分離出多種擁有抗腫瘤活性的多糖，進(jìn)而應(yīng)用于相關(guān)抗腫瘤藥物的制備，或者為疫苗的研發(fā)提供支持。鐘閏等研究發(fā)現(xiàn)，杜氏鹽藻胞外多糖（DsEPS）可抑制Hela細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞活力，改變細(xì)胞形態(tài)，表明DsEPS有抗腫瘤活性，并初步探明了其抗腫瘤機(jī)制，今后進(jìn)一步研究多糖抗腫瘤提供有效參考[18]。劉城移等研究表明，蟬蟲(chóng)草Cordyceps cicadae的胞內(nèi)和胞外多糖均可極顯著抑制HepG-2細(xì)胞活性（P<0.01），半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為3.23、0.45mg/mL，細(xì)胞遷移率分別為38.72%、24.79%，提示胞外多糖比胞內(nèi)多糖具有更強(qiáng)的抗肝癌細(xì)胞HepG-2活性[19]。馬文錦等對(duì)膠紅酵母胞外多糖組分（Rhodotorula mucilaginosa exo-polysaccharide2-A，REPS2-A）抑制10種常見(jiàn)癌細(xì)胞能力進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，胞外多糖組分REPS2-A能有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖，使肝癌細(xì)胞HepG2阻滯發(fā)生在G1/S期，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡，且存在劑量效應(yīng)[20]。李輝等研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌RH的不同質(zhì)量濃度EPS可以顯著延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）和凝血酶時(shí)間（TT）。說(shuō)明EPS具有一定的抗凝血活性，并且抑制凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白的形成來(lái)發(fā)揮抗凝血功效[21]。

在環(huán)境領(lǐng)域，一些胞外多糖具有絮凝能力，并能夠吸附重金屬，可作為生物絮凝劑在污水處理方面發(fā)揮作用。關(guān)志國(guó)等研究了紅球菌HX-2所產(chǎn)胞外多糖對(duì)水體中Cu2+的吸附作用，發(fā)現(xiàn)通過(guò)等溫吸附模型擬合得到HX-2胞外多糖對(duì)Cu2+的最大吸附量為144.93mg/g，其對(duì)Cu2+具有良好的吸附作用，可用于工業(yè)廢水中重金屬離子的處理[22]。除此之外，胞外多糖在其他方面也有應(yīng)用，如在農(nóng)業(yè)方面，在Cd脅迫條件下的水稻幼苗經(jīng)過(guò)屎腸球菌胞外多糖處理后的內(nèi)類黃酮與花色素苷的含量提高18.6%～208.7%，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶的活力顯著上升，丙二醛含量顯著下降[23]。胞外多糖在幫助植物抵抗干旱，促進(jìn)植物幼苗生長(zhǎng)方面有著較大的作用。隨著國(guó)內(nèi)外不斷對(duì)胞外多糖研究的發(fā)展，相信其應(yīng)用范圍會(huì)越來(lái)越廣泛。

5 總結(jié)與展望

多糖作為一種天然活性大分子物質(zhì)，是基本的生命物質(zhì)之一，存在極為特殊的生物學(xué)功能，在食品、藥物研制和生物制品等方面的發(fā)展前景非常好。提高胞外多糖萃取率的關(guān)鍵在于微生物表面多糖的溶解量，通過(guò)萃取劑、高壓脈沖以及超聲波等手段加速微生物表面多糖溶解，利于多糖萃取。微生物胞外多糖在營(yíng)養(yǎng)缺乏、高光誘導(dǎo)、高鹽脅迫、低溫培育、重金屬離子誘導(dǎo)等環(huán)境脅迫條件下，會(huì)適應(yīng)性地向胞外發(fā)酵培養(yǎng)基環(huán)境中分泌大量的胞外多糖（EPS）。胞外多糖生物活性顯著，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和提高免疫功能等多重生物活性，醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用前景十分廣闊。微生物胞外多糖在食品業(yè)的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，在創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)的同時(shí)提高了食品的品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]穆甲駿，王衛(wèi)國(guó)，侯啟昌.苦參生理活性物質(zhì)研究現(xiàn)狀與展望[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，42（06）：131-137.

[2]宋紹富，崔吉，羅一菁，等.微生物多糖研究進(jìn)展[J].油田化學(xué)，2004（01）：91-96.

[3]郭敏，張寶善，金曉輝.微生物發(fā)酵生產(chǎn)多糖的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào)，2008（07）：1084-1090.

[4]張曉玲.細(xì)菌胞外多糖的制備及特性研究[D].大連：大連工業(yè)大學(xué)，2012.

[5]馬晶璟.產(chǎn)胞外多糖細(xì)菌的分離和鑒定[D].合肥：安徽大學(xué)，2010.

[6]Weaver J C，Chizmadzhevb Y A.Theory of electroporation： A review[J].Bioelectrochemistry and Bioenergetics，1996，41：135-160.

[7]李成祥，孫才新，姚陳果，等.電穿孔過(guò)程中細(xì)胞膜電導(dǎo)率變化條件下的跨膜電壓研究[J].中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2011，30（04）：576-581.

[8]張鐵華，王少君，劉迪茹，等.脈沖電場(chǎng)提取西藏靈菇胞外多糖條件優(yōu)化[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2011，41（03）：882-886.

[9]張玉，劉超.高壓脈沖電場(chǎng)法提取羊肚菌多糖及其分離純化[J].食品工業(yè)，2016，37（12）：54-58.

[10]孟江平，李忠彬，廖文利，等.超臨界CO2流體萃取在中藥有效成分提取中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（22）：13565-13567.

[11]李曄，金凌云，華正根.灰樹(shù)花多糖的超臨界CO2提取方法研究[C]?福建省科協(xié)第十三屆學(xué)術(shù)年會(huì)分會(huì)暨2013年福建省食用菌學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì).2013.

[12]楊孝輝，郭君.響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2流體萃取淮山多糖工藝[J].食品工業(yè)科技，2019，40（07）：185-189，198.

[13]王大為，單玉玲，圖力古爾.超臨界CO2萃取對(duì)蒙古口蘑多糖提取率的影響[J].食品科學(xué)，2006（03）：107-110.

[14]吳學(xué)昊.微波輔助—雙水相萃取山豆根中有效成分的研究[D].廣州：廣東藥科大學(xué)，2016.

[15]劉琳，宋麗敏.樺褐孔菌發(fā)酵液中三萜化合物和多糖的微波輔助雙水相萃取[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2016，42（05）：246-252.

[16]崔艷紅，黃現(xiàn)青.微生物胞外多糖研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2006（02）：25-28，42.

[17]謝夢(mèng)煥，沈楠，朱婉，等.黃原膠對(duì)饅頭冷藏期間品質(zhì)變化的影響[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2017（11）：6-8.

[18]鐘閏，吳思偉，何秀苗，等.杜氏鹽藻胞外多糖抗腫瘤活性及其機(jī)制研究[J].食品工業(yè)科技，2020，41（22）：126-133.

[19]劉城移，郝心怡，林沛霖，等.1株野生蟬蟲(chóng)草的鑒定及其胞內(nèi)和胞外多糖抗肝癌活性比較[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，48（12）：117-126.

[20]馬文錦，李梅林，王博，等.膠紅酵母CICC 33013胞外多糖抑制肝癌細(xì)胞活性研究[J].食品與機(jī)械，2020，36（02）：159-164.

[21]李輝，宋居易，劉蕾，等.雙歧桿菌RH胞外多糖提取純化及體外抗凝血活性評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué)，2014，35（23）：129-133.

[22]關(guān)志國(guó)，王曉花，常世輝，等.紅球菌HX-2所產(chǎn)胞外多糖的特性和對(duì)Cu2+的吸附[J].微生物學(xué)通報(bào)，2020，47（10）：3171-3182.

[23]羅晟，趙澤文，任新宇，等.屎腸球菌胞外多糖對(duì)鎘脅迫下水稻種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2020，39（09）：1888-1899.

（責(zé)編：張宏民）