PPAR-γ對人胰腺癌BxPc-3細胞增殖的影響

李博 施景龍 邱厚匡 許鳴

【關鍵詞】過氧化物酶體增殖物激活受體-γ;胰腺癌;細胞增殖

胰腺癌是消化系統惡性程度高、預后差的惡性腫瘤之一，由于其侵襲性強，早期往往已經浸潤大血管、神經等，造成手術切除難度大，嚴重降低生存率，5年總體生存率不足1%[1]。過氧化物酶體增殖物-γ（PPAR-γ）除參與脂肪代謝、炎癥反應和細胞周期的調控等細胞功能調節外，還與腫瘤發生關系密切[2]。筆者前期試驗表明促進PPAR-γ表達可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3細胞上皮間充質轉化（EMT）及侵襲性[3]。本實驗擬明確調控PPAR-γ表達對BxPc-3細胞增殖活性的影響。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌BxPc-3細胞購自上海中科院細胞研究所;PPAR-γ激動劑羅格列酮購自美國Sigma;胰酶、高糖DMEM培養基購自美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑盒購自中國碧云天公司;鼠抗人PPAR-γ抗體及GAPDH內參購自南京凱基公司。

二、方法

1.細胞株與培養

人胰腺癌BxPc-3細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液于37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞均呈貼壁生長。每2～3d用0.25%胰酶消化傳代1次。根據前期研究經驗，將BxPc-3細胞分5組處理96h，分別為不加藥物的對照組（對照組）、加入終濃度5μmol/L羅格列酮組（5μmol/L羅格列酮組）、加入終濃度10μmol/L羅格列酮組（10μmol/L羅格列酮組）、加入終濃度20μmol/L羅格列酮組（20μmol/L羅格列酮組）、加入終濃度40μmol/L羅格列酮組（40μmol/L羅格列酮組）。

2.PPAR-γ表達水平的檢測

采用蛋白免疫印跡法：收集對數生長期BxPc-3細胞，各組BxPc-3細胞加藥后加入600μlRIPA細胞裂解液，離心30min，收集上清液即總蛋白，加2倍體積十二烷基酸鈉上樣緩沖液，電泳后轉移至醋酸纖維膜上，脫脂奶粉封閉，加入相應一抗（PPAR-γ抗體，1∶100），4℃孵育過夜，洗膜3次，加入羊抗鼠二抗（1∶10000），37℃孵育2h，電化學發光（ECL）法檢測，感光顯影。AlphaImager2200圖像系統分析灰度值，以GAPDH為內參，計算各組細胞的PPAR-γ表達水平。實驗組每組設4個平行孔，實驗獨立重復3次，結果取平均值。

3.BxPc-3細胞增殖活性的檢測

3.BxPc-3細胞增殖活性的檢測采用MTT法檢測：收集對數生長期的BxPc-3細胞，各組BxPc-3細胞加藥處理后加入20μlMTT溶液，孵育4h，再加入150μl二甲基亞砜（DMSO）震蕩10min，使用ELISA檢測儀于490nm波長處測量各組吸光度值（增殖活性）。每組設4個平行孔，實驗獨立重復3次，結果取平均值。

三、統計學處理

使用SPSS16.0處理數據。實驗數據用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、不同濃度羅格列酮對BxPc-3細胞PPAR-γ表達水平的影響

5組BxPc-3細胞PPAR-γ表達水平比較差異有統計學意義（F=40.922，P<0.001）。5μmol/L羅格列酮組、10μmol/L羅格列酮組BxPc-3細胞的PPAR-γ表達水平與對照組比較差異均無統計學意義（P均>0.05），但20μmol/L羅格列酮組、40μmol/L羅格列酮組BxPc-3細胞的PPAR-γ表達水平升高，與對照組比較差異均有統計學意義（P均<0.05），且40μmol/L羅格列酮組BxPc-3細胞的PPAR-γ表達水平高于5μmol/L羅格列酮組、10μmol/L羅格列酮組和20μmol/L羅格列酮組（P均<0.05），見圖1。

二、不同濃度羅格列酮對BxPc-3細胞增殖活性的影響

MTT檢測顯示，5組BxPc-3細胞增殖活性比較差異有統計學意義（F=19.966，P<0.001）。5μmol/L羅格列酮組、10μmol/L羅格列酮處理后BxPc-3細胞增殖活性分別為0.60±0.07、0.57±0.06，與對照組的0.62±0.09比較差異均無統計學意義（P均>0.05）;40μmol/L羅格列酮組細胞增殖活性為0.30±0.02，低于20μmol/L羅格列酮組的0.45±0.03，且2組BxPc-3細胞增殖活性均低于對照組、5μmol/L羅格列酮組和10μmol/L羅格列酮組（P均<0.05），見圖2。

討論

PPAR是一類由配體激活的轉錄因子，有α、β和γ這3種亞型，3種亞型在功能和結構有一定差異[4]。PPAR-γ配體分為外源性和內源性2大類，其中外源性配體以胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物為代表，包括羅格列酮、吡格列酮等，臨床用于治療胰島素抵抗、糖尿病等，內源性配體則包括一些不飽和脂肪酸及其代謝產物，如花生四烯酸、亞油酸等，還有前列腺素衍生物、前列腺素D2等，這些天然激動劑活性都較低[5-6]。

PPAR-γ最初發現是與胰島素抵抗、脂肪細胞分化和器官纖維化等有關。近年研究顯示其與腫瘤發生關系密切。已有報道PPAR-γ在胃癌、結腸癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、乳腺癌、食管癌和淋巴瘤等多種惡性腫瘤中表達[7]。Tsujie等（2003年）報道PPAR-γ在包括BxPc-3細胞在內的6種胰腺癌細胞株上表達。Kristiansen等（2006年）在129例胰腺癌患者的癌組織中檢測PPAR-γ，71.3%的病例中有PPAR-γ的表達，且其表達與胰腺癌的分級和分期呈正相關，推測PPAR-γ與胰腺癌有關。PPAR-γ在胰腺癌中的確切作用機制尚未闡明。Eibl等（2001年）認為，PPAR-γ可能通過誘導胰腺癌細胞凋亡，進而阻止胰腺癌細胞生長。

筆者前期研究使用羅格列酮促進BxPc-3細胞中PPAR-γ表達，結果顯示羅格列酮可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3細胞EMT及侵襲性。本實驗中筆者繼續將不同濃度羅格列酮作用于BxPc-3細胞，結果顯示20、40μmol/L羅格列酮可以有效促進PPAR-γ的表達，且40μmol/L羅格列酮組BxPc-3細胞的PPAR-γ表達高于20μmol/L羅格列酮組。MTT結果提示20μmol/L羅格列酮組、40μmol/L羅格列酮組BxPc-3細胞增殖活性明顯下降，表明PPAR-γ表達可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3細胞增殖活性。

綜上所述，本研究結果初步揭示了PPAR-γ激動劑的抗胰腺癌細胞增殖特性，而探索PPAR-γ參與人胰腺癌BxPc-3細胞增殖及EMT的信號傳導通路將是我們下一步的研究方向。