miR-190通過調(diào)控細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子5促進肝細胞癌發(fā)生的機制

王運九 孫健 李玲霞 郭金虎 張玨

【關(guān)鍵詞】肝細胞癌;微核糖核酸-190;細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子5;增殖

肝細胞癌（HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因，占原發(fā)性肝癌的80%，嚴重威脅人類健康[1-2]。隨著對HCC分子生物學(xué)研究的不斷深入，已鑒定出與該疾病有關(guān)的不同基因和途徑。為了更好地理解HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機制，亟待發(fā)現(xiàn)更精準(zhǔn)的預(yù)后標(biāo)志物及有效的治療策略。張春艷等（2016年）認為作為一類非編碼單鏈RNA分子，微RNA（miR）與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。miR-144的高表達可明顯抑制裸鼠肝癌形成[3]。近期研究表明，miR-190可以通過抑制ZEB2的表達來抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長和遷移[4]。然而，miR-190在HCC中的表達、潛在作用和機制仍不清楚。本研究探討miR-190通過調(diào)控細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子5（SOCS5）參與HCC發(fā)生與發(fā)展過程的關(guān)鍵作用與機制。

材料與方法

一、研究對象

選取2019年5月至2019年12月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院接受手術(shù)切除且病理確診為HCC的患者84例，其中男58例、女26例，年齡（63±5）歲。收集HCC癌組織及對應(yīng)的癌旁組織（距腫瘤邊緣≥2cm）。患者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院倫理委員會審核通過。

二、細胞、動物及主要試劑

SNU398和HepG2細胞均購于中國科學(xué)院上海細胞研究所。24只雌性無胸腺裸鼠，4～6周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。SOCS5、β-actin抗體購自Sigma公司;miR-190模擬物/抑制物和Dharmafect1購自Dharmacon公司;靶向SOCS5的psiCHECK-2載體購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑、miR定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司;Transwell小室購自Corning公司;Mgteigel基質(zhì)膠購自BD公司。

三、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

SNU398和HepG2細胞分別用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前將細胞接種于12孔板中，待細胞達到每孔150000個細胞的密度時，根據(jù)說明書將miR-190模擬物/抑制物或SOCS5siRNA（siSOCS5）及各自的陰性對照（模擬物NC/抑制物NC或siNC）分別用Dharmafect1和Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染至細胞。

四、細胞活力

根據(jù)細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）說明書測定細胞活力。將轉(zhuǎn)染細胞按1×103個/孔接種于96孔板，每孔加入10μlCCK-8溶液，在37℃下孵育2h。用酶標(biāo)儀檢測450nm波長下細胞的吸光度。

五、Transwell侵襲與遷移實驗

取100μl基質(zhì)膠稀釋液鋪于Transwell小室上室，含胎牛血清的常規(guī)培養(yǎng)基加入下室，細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。擦去上室細胞與基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計算侵襲細胞數(shù)。遷移實驗無需鋪膠，其余操作同侵襲實驗。

六、裸鼠異種移植腫瘤

于裸鼠腹側(cè)皮下接種1.5×106個用siNC或siSOCS5轉(zhuǎn)染的SNU398或HepG2細胞。對腫瘤生長進行長達18d的監(jiān)測，并通過以下公式計算腫瘤體積：體積=（L×W2）/2，其中L為腫瘤的長度，W為腫瘤的寬度。

七、RNA提取和實時熒光定量PCR（RT-PCR）

采用TRIzol法提取HCC組織、癌旁組織、轉(zhuǎn)染后的SNU398或HepG2細胞中的總RNA。根據(jù)miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，隨后，使用7900HT快速實時PCR系統(tǒng)（ThermoFisherScientific）進行RT-PCR。miR-190以U6為內(nèi)參，SOCS5以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算結(jié)果。引物序列見表1。

八、蛋白免疫印跡法

利用RIPA裂解液提取細胞蛋白，并用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。將10μg總蛋白上樣后，進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉2h后，加入SOCS5抗體（1∶1000）或β-actin抗體（1∶2000），4℃孵育過夜。TBST沖洗3次后，加入二抗，室溫孵育lh，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。

九、熒光素酶測定

構(gòu)建野生型和突變型基因靶點SOCS5的3′UTR-熒光素酶表達載體（SOCS5-Wt和SOCS5-Mut），使用Lipofectamine3000將其與miR-190模擬物和陰性對照同時分別轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72h后，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)（上海吉馬生物制藥有限公司）連續(xù)測量螢火蟲-海腎熒光素酶的活性。

十、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPadPrism8.0分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布定量資料以表示，定性資料以例表示。采用配對t檢驗分析癌組織和癌旁組織間的差異，獨立樣本t檢驗分析體外定量數(shù)據(jù)，兩因素重復(fù)測量方差分析轉(zhuǎn)染時間與分組間的差異，χ2檢驗分析miR-190表達與臨床特征的關(guān)系。生存曲線采用Kaplan-Meier法，log-rank檢驗進行比較。α=0.05。

結(jié)果

一、miR-190是HCC中潛在的癌基因

與來自同一HCC患者的癌旁組織相比，HCC癌組織中miR-190水平上調(diào)（t=6.849，P<0.001，圖1A）。將84例HCC組織以miR-190的中位表達水平分為高表達組（>中位數(shù)，40例）和低表達組（≤中位數(shù)，44例），分析miR-190的表達量與HCC患者臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR-190的表達量與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P均<0.05），見表2。

miR的高水平與HCC患者的預(yù)后不良有關(guān)（HR=0.656，95%CI0.352～0.933，P=0.027，圖1B）。miR-190的過表達提高SNU398和HepG2細胞的體外增殖能力（t=4.465，P<0.001;t=2.824，P=0.005，圖1C）。

二、下調(diào)miR-190的表達抑制肝癌細胞侵襲及遷移能力

下調(diào)miR-190處理SNU398和HepG2肝癌細胞后，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-190的表達抑制了肝癌細胞的侵襲（t=13.120，P<0.001;t=7.398，P=0.002）及遷移能力（t=5.587，P=0.005;t=4.082，P=0.015），見圖2。

三、miR-190直接靶向SOCS5

借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫StarBase3.0對miR-190的靶基因進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)SOCS5可能是miR190的潛在靶點（圖3A）。為了驗證該假設(shè)，我們通過RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測了miR-190對SOCS5轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的影響。結(jié)果顯示，miR-190的過表達導(dǎo)致SNU398和HepG2細胞中SOCS5mRNA（t=3.212，P=0.033;t=3.597，P=0.023，圖3B）和蛋白（t=2.895，P=0.044;t=2.813，P=0.048，圖3D）表達減少，而抑制miR-190導(dǎo)致SOCS5mRNA（t=8.249，P=0.001;t=3.865，P=0.018，圖3C）和蛋白表達（t=3.098，P=0.036;t=8.835，P=0.001，圖3E）的增加。

當(dāng)miR-190與SOCS5-Wt共同轉(zhuǎn)染到SNU398細胞中時，熒光素酶活性下降（t=5.983，P=0.004），SOCS53UTR結(jié)構(gòu)中的點突變可消除這種效應(yīng)（t=0.676，P=0.536，圖3F）。在HepG2細胞中也獲得了類似的結(jié)果（圖3G）。

四、SOCS5是HCC的腫瘤抑制因子

靶向siRNA可有效下調(diào)SNU398和HepG2細胞中的SOCS5水平（t=3.342，P=0.028;t=9.887，P=0.001，圖4A）。

在體外，兩因素重復(fù)測量方差分析顯示SNU398和HepG2細胞的增殖隨時間變化呈上升趨勢（F時間=277.7和233.3，P均<0.001，圖4B），siSOCS5組增殖能力高于siNC組（F組間=36.6和34.2，P均<0.001），分組與時間有交互效應(yīng)（F=15.4和9.656，P均<0.001）。此外，轉(zhuǎn)染siSOCS5的細胞遷移（t=2.946，P=0.042;t=7.258，P=0.002）和侵襲能力（t=2.876，P=0.045;t=8.764，P=0.001）均增強（圖4C）。我們在異種移植腫瘤模型中進一步評估了SOCS5基因敲除對HCC細胞腫瘤發(fā)展過程中的作用。與陰性對照相比，SOCS5基因敲除導(dǎo)致SNU398和HepG2細胞的異種移植腫瘤體積（t=2.829，P=0.047）和質(zhì)量（t=7.635，P=0.002）增加（圖4D）。

討論

Xue等（2016年）研究顯示，HCC是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，分子異質(zhì)性的存在和生物標(biāo)志物的缺失可導(dǎo)致晚期患者預(yù)后不良，從而影響癌癥的治療效果。因此，尋找預(yù)后標(biāo)志物及新的分子靶點是該疾病面臨的主要挑戰(zhàn)之一。miR在腫瘤分類和預(yù)后方面發(fā)揮重要作用，其異常的表達可作為肝癌的標(biāo)志。近年來，大量研究在肝癌中發(fā)現(xiàn)了與肝癌風(fēng)險增加、腫瘤發(fā)生發(fā)展、晚期和血管浸潤相關(guān)的miR信號，并將miR作為治療靶標(biāo)[1，3]。

有研究顯示在侵襲性神經(jīng)母細胞瘤和前列腺癌中miR-190表達減少，而在快速生長的腫瘤中其過度表達會抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，miR-190還調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[5]。相反，Jia等（2016年）研究顯示miR-190在胃癌組織中表達上調(diào)，并促進胃癌的進展。這提示miR-190可能在不同的腫瘤環(huán)境和腫瘤發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用。而關(guān)于miR-190在肝癌中的作用的研究目前較少，如Hung等（2014年）發(fā)現(xiàn)miR-190b的上調(diào)對誘導(dǎo)人HCC胰島素抵抗的IGF-1降低起作用。本研究首先發(fā)現(xiàn)miR-190在HCC腫瘤中上調(diào)，且miR-190高表達與HCC患者的不良預(yù)后有關(guān)，提示其可能在HCC發(fā)展過程中起促進作用。此外，我們檢測了miR-190過表達對HCC細胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-190過表達能促進細胞增殖，而下調(diào)miR-190抑制了肝癌細胞的侵襲及遷移能力，表明miR-190通過促進HCC細胞增殖、侵襲和遷移等來發(fā)揮其促癌作用。這些結(jié)果與在胃癌中的觀察結(jié)果相一致。

當(dāng)miR-190過表達時，SOCS5在HCC細胞系中下調(diào)，由此我們推測SOCS5是miR-190的潛在靶點。SOCS5在人類癌癥中的作用已被研究，在前列腺癌和肝癌中已經(jīng)檢測到SOCS5的下調(diào)[6]。據(jù)報道，抑制miR-18a-5p促進SOCS5而誘導(dǎo)骨肉瘤細胞凋亡[7]。隨后，我們使用熒光素酶檢測法證明了它確實是miR-190的靶點，同時，miR-190還能調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。有趣的是，SOCS基因是JAK/STAT通路中負反饋回路的一部分[8]。眾所周知，JAK/STAT途徑可激活細胞的增殖、遷移、分化、凋亡以及抑制劑的失調(diào)，導(dǎo)致包括肝癌在內(nèi)的人類疾病[9]。Yuan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a靶向SOCS-1，并通過JAK/STAT信號通路抑制膿毒癥大鼠的肝細胞增殖和促進細胞凋亡。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)了板藍根多糖通過激活JAK/STAT信號通路來發(fā)揮對HBV的體外抗病毒作用。考慮到目前SOCS5與肝癌的相關(guān)研究較少，我們進行了額外實驗來驗證SOCS5在肝癌中的作用，結(jié)果證明了SOCS5在體內(nèi)和體外都可作為HCC的腫瘤抑制因子。以上結(jié)果表明，在HCC中，由miR-190介導(dǎo)的SOCS5下調(diào)將導(dǎo)致JAK/STAT通路的激活，進而促進細胞增殖、侵襲和遷移。有研究報道m(xù)iR-885-5p上調(diào)通過靶向抑制SOCS5促進大腸癌細胞增殖和遷移，我們的研究結(jié)果與其一致[12]。

綜上所述，我們驗證了細胞因子家族抑制因子之一的SOCS5作為miR-190在肝癌中的真實靶點，并證明了SOCS5在肝癌中的抑瘤作用。此外，我們強調(diào)了miR190的抑制作用在恢復(fù)SOCS5水平方面的潛在用途，從而降低肝癌細胞的致瘤特性。這項研究強調(diào)了miR-190在肝癌研究中的重要性，不僅是作為潛在的生物標(biāo)志物，而且有可能成為待開發(fā)潛在藥物的新的分子靶標(biāo)。