響應面法在儀器分析實驗教學中的應用
——以響應面法優化HPLC測定飲料苯甲酸的條件為例

加列西·馬那甫，賈娜爾·吐爾遜，萬越，馬福東

新疆農業大學化學工程學院，烏魯木齊 830052

1 選擇背景

儀器分析實驗課程是理論課程的重要組成部分，為學生提供研究思路和分析方法。課程所用的儀器涉及多種學科和分析方法；教學難度較大，教師花很多時間講解，學生卻仍一頭霧水，易產生畏難情緒，學習積極性不高。解決上述問題的有效途徑是豐富和改進教學方式方法，讓學生參與創新性實驗設計，充分發揮學生的實驗自主性，培養學生發現問題、分析問題和解決問題的能力[1–4]。響應面分析法是統計和數學方法的結合，可采用多元二次回歸方程對受多個變量影響的問題進行建模和分析，優化各試驗因素水平的響應值；主要包括試驗設計、響應面擬合及優化計算等步驟。而將響應面法應用到儀器分析實驗課程具有一定的難度和挑戰性。在儀器分析實驗教學中采用響應面分析法進行試驗設計，可以培養學生的自學、科研能力[5,6]。下面以響應面法優化HPLC測定飲料苯甲酸的條件實驗為例，將響應面法應用于儀器分析實驗教學中[7–9]。

2 教學方法與內容的改進

實驗教學內容的設計既要滿足教學大綱要求，又要有基本操作和技能訓練；同時必須不斷更新內容，與學科發展相結合。因此，實驗內容要綜合考慮各方面的因素。

2.1 教學方法的改進

傳統的實驗教學方法是，教師做實驗前期工作，學生不參與實驗準備工作，處于被動學習地位，對過程一無所知。因此，通過讓學生參與到實驗的前期準備工作中，激發學生學習的主動性，同時培養學生獨立思考創新的能力。在課程的講授過程中，教師不是按部就班的教學，而是讓學生參加實驗的前期準備工作。激發學生的求知欲望，開展自由討論，最后教師進行歸納總結。在整個過程中師生共同實驗，通過及時糾正操作上的錯誤來達到實驗操作規范化的要求。實驗結束后學生寫實驗報告，并由實驗教師進行評閱、打分。

2.2 實驗內容的改進

將響應面法應用于儀器分析實驗教學，選取“響應面法優化HPLC測定飲料苯甲酸的條件”實驗，首先進行兩水平的Plackett-Burman設計方法，Plackett-Burman設計(以下簡稱P-B設計)是一種經濟而有效的實驗方法，可以用較少的實驗達到分析各因素主效應的效果；可以快速地從眾多因素中篩選出對實驗條件有顯著影響的因素，從而達到篩選的目的，避免在優化實驗中由于部分因素不顯著而浪費實驗資源。針對影響因素，可用單因素實驗結果來選擇，并進行放大實驗，以驗證優化條件的合理，得到最后的響應值。對于響應面法優化HPLC測定飲料苯甲酸的條件實驗，選取的主要因素有超聲時間(A)、氨水濃度(B)和pH值(C)為自變量。根據Plackett-Burman試驗篩選出的顯著因子效應的大小設計它們的變化方向和步長，取各因素的中點作為最陡爬坡實驗的中心點，以垂直于擬和曲面等高線的直線方向為實驗值變化的梯度方向。根據最陡爬坡試驗得到的中心點，利用Design-Experts軟件對確定的影響因素進行中心復合設計，對試驗數據進行最小二乘二次回歸，得到帶交互項和平方項的二次方程，通過方差分析各因素的主效應和交互效應，在一定范圍求出最優條件。該方法的目的是利用數學模型描述因素與響應值的關系，在此基礎上，確定其最佳條件。該方法能在設計合理的有限次數實驗下，評價各因素對響應值以及各個因素之間的交互作用，最后求得其最優化條件[10]。

3 響應面法實驗設計與分析實例

綜合單因素實驗結果，根據Box-Benhnken實驗設計原理，采用響應面法，在三因素三水平上對飲料中苯甲酸的測定條件進行優化研究。

3.1 實驗步驟

3.1.1 標準曲線的配制

加水稀釋成0、20、40、60、80和100 μg·mL?1的苯甲酸標準系列溶液，過濾。按色譜條件，進樣測定。

以苯甲酸峰面積A為縱坐標，苯甲酸質量濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y= 0.7 ×104x+ 131634，線性相關系數為R= 0.9988。

3.1.2 樣品前處理

精取飲料樣品10.00 mL，超聲一定時間除去CO2，用氨水調節pH約為7，加水定容至100.0 mL，濾膜過濾，待測。

3.2 響應面法優化飲料中苯甲酸的提取率

3.2.1 試驗安排與結果

根據單因素試驗結果、以超聲時間(A)、氨水濃度(B)、pH值(C)為自變量，苯甲酸提取率(Y)為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗。響應面因素水平編碼見表1；響應面分析試驗結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素和水平

表2 響應面試驗設計及數據處理

3.2.2 模型方程的建立與方差分析

應用SAS軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得到超聲時間、氨水濃度、pH值與飲料苯甲酸提取率之間的二次多項回歸方程：

根據表3中的P值可以評判模型中各項對響應值影響的顯著程度，即P< 0.01表示“高度顯著”，0.01 0.05表示“不顯著”。模型項P< 0.01說明y與x1回歸方程的關系是極顯著的，該模型可用。失擬項越小越好，對應的P值越大越好，如果P> 0.05，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，說明y與x回歸方程的關系是好的，否則可能是有的因素沒有考慮到。

表3 方差分析結果

3.2.3 響應曲面分析

應用Design-Expert軟件進行進一步優化；根據回歸模型作出相應的響應曲面圖和等高線圖，考查擬合響應曲面的形狀，分析各因素對飲料中苯甲酸提取率的影響，結果見圖1。

圖1 各因素交互作用的響應面和等高線圖

圖1為所得的優化響應曲面圖，反映了三因素中任意兩因素的交互作用對苯甲酸提取率的影響。圖形曲面呈現為陡峭則表明該因素對提取率影響顯著，響應值比較敏感；曲面呈現為平緩則表明該因素對提取率影響不顯著，響應值不敏感。等高線的形狀則反映任意兩因素的交互作用的強弱，橢圓形表明兩因素交互作用強，對提取率的影響較顯著，圓形表明兩因素交互作用弱，對提取率的影響不顯著。

3.2.4 參數優化

通過軟件分析，響應面法優化飲料中苯甲酸的最佳條件為超聲時間10.0 min、氨水濃度12.5%、pH為7.0。在此條件下，苯甲酸的提取率為140 mg·kg?1。

4 結語

4.1 激發學生興趣

學生根據興趣和理解程度鞏固和消化所學知識，縮減了教師課程上枯燥說教的時間，又培養了學生的自學能力、學習興趣。此外將響應面法應用于儀器分析實驗教學中，學生根據設計題目將整個實驗內容更清晰直觀地展示出來，通過對實驗結果進行科學分析，培養了學生的獨立思維能力和基本科研素質。

4.2 提高學生的動手能力

采用響應面法設計實驗，學生必須通過多次實驗才能得到實驗結果。允許學生在課余時間進入實驗室，通過前期實驗掌握實驗技術，緩解大型分析測試儀器不足的矛盾。整個實驗過程是一種探究過程，重在科研能力的訓練和創新思維的培養。實驗教學中將開放式實驗教學和科技訓練相結合，形式靈活，不受課時限制，是值得大力推廣的新教學手段。

4.3 培養學生的團隊精神

應用Design-Experts軟件進行實驗設計以拓展實驗形式開展，分組做不同題目；構建新的實驗內容體系，避免了傳統實驗教學的內容單一、重復、無創新性的弊端。同時，響應面法利用實驗數據建立數學模型來解決受多因素影響的最優組合問題，可以在更廣泛的范圍內考慮因素組合、預測響應值。響應面法優勢明顯，如試驗次數少，精度高，適合于多因素、多水平試驗。另一方面，學生作為主角，充分參與前期準備工作，能彌補傳統實驗教學不足，培養學生的實驗設計能力、應用軟件能力、科研能力等。

4.4 促進教師自身素質的提高

儀器分析實驗課程采用響應面法進行實驗設計，指導教師不僅需要具備系統的理論知識和熟練的操作技能，還必須結合學科發展前沿提出新的實驗選題，指導學生分析和解決實驗中出現的新問題，以創新思維影響和培養學生。這也是一種加強教學科研相結合、促進教師隊伍整體素質提高的新途徑。軟件應用與實驗教學的結合，使實驗課程更接近科學研究，提高學生的學習積極性，促進教學相長，實現教改目的。實驗課程對學生的綜合能力要求較高，為學生的畢業論文實驗和今后的生產實踐打下良好的理論基礎[11]。