碳量子點的制備及其在生物巰基化合物檢測中的應用
——推薦一個大學化學研究型綜合實驗

郭穎，尚永輝，鄭敏燕

咸陽師范學院化學與化工學院，陜西 咸陽 712000

碳量子點簡稱碳點，是一種尺寸小于10 nm的新型熒光碳納米材料。由于具有良好的熒光特性，同時具有尺寸小、水溶性好、毒性低、生物相容性好、合成成本低等優異性能，已成為基于熒光光譜檢測生物標志物的新型熒光探針候選物。經過十幾年的發展，碳點已經在生物傳感、環境監測及生命診療等領域展現出了廣闊的應用前景[1–3]。為了將科研工作與實驗教學相結合，將這一前沿領域研究介紹給學生，我們以科研課題研究成果為基礎，設計了“碳量子點的制備及其在生物巰基化合物檢測中的應用”這一研究型綜合實驗。實驗內容主要包括碳點合成、碳點的表征以及基于熒光“offon”測定巰基化合物。首先以天然植物為碳源通過一步水熱法合成熒光碳點，再通過紫外-可見光譜、熒光光譜等對碳點進行表征。再利用Cu2+可猝滅碳點的熒光，而在生物巰基化合物存在時碳點的熒光恢復的現象，實現對生物巰基化合物的檢測。通過本綜合實驗，使學生熟悉納米材料合成、形貌結構表征、光學性能測試等相關原理，并掌握相關基本實驗技能。教學實踐表明，該實驗對學生消除科技前沿神秘感、激發學生實驗興趣、提升學生的創新意識和綜合運用知識能力等方面效果顯著。

1 實驗目的

(1) 了解碳點的性質及應用領域。

(2) 學習碳點的制備及表征方法。

(3) 熟悉熒光光譜、紫外-可見吸收光譜的原理及操作。

(4) 學習基于熒光探針“off-on”型檢測原理及方法。

2 實驗原理

實驗設計如圖1所示。碳點在制備過程中除需碳源材料外，通常還需要加入鈍化劑或摻雜劑以調節碳點的結構和熒光性能。在此，摻雜是將碳源材料與含摻雜異元素材料進行共合成，讓摻雜元素直接參與碳核的形成[4,5]。苜蓿和大蒜因含有豐富的碳水化合物可作為碳點合成的碳源材料，并且苜蓿和大蒜中氮、硫含量均較高，因此在合成碳點過程中可自我摻雜形成氮、硫共摻雜的碳點。

圖1 碳點的合成及其熒光檢測生物巰基化合物原理示意圖

所合成的氮及硫摻雜碳點具有強的熒光，而Cu2+的外層電子結構是4s13d9，外圍的d軌道不是全充滿狀態，因此，加入Cu2+后，碳點的電子被轉移到Cu2+的d軌道上，進而碳點熒光猝滅。當向碳點-Cu2+體系中加入硫醇衍生物(以半胱氨酸Cys作為研究對象)后，Cys能通過絡合作用使Cu2+從碳點的表面被移除[6]，碳點的熒光強度也隨之發生改變。將上述熒光強度變化與檢測物Cys含量相關聯，即可實現對Cys的檢測。

3 試劑和儀器

3.1 實驗試劑

大蒜、苜蓿取自咸陽周邊農田，使用前用二次蒸餾水清洗若干次。本實驗所用其余試劑見表1，實驗所用超純水由Milli-Q-Plus系統(18.2 MΩ·cm?1)提供。

表1 主要試劑

3.2 實驗儀器

本實驗所用主要儀器見表2。

表2 主要實驗儀器

4 試劑和儀器

4.1 Cys溶液的配制

在分析天平上準確稱取0.0351 g的Cys置于小燒杯中，加入少量蒸餾水溶解后，定容至50 mL，配制成4.0 × 10?3mol·L?1Cys標準溶液，使用時逐級稀釋至所需濃度。

4.2 N, S共摻雜碳點的制備

將切成均勻碎塊的2 g苜蓿和2 g大蒜加入到聚四氟乙烯內襯的反應釜內，并加入26 mL超純水。在230 °C烘箱中恒溫加熱4 h后，自然冷卻至室溫，混合液在13000 r·min?1下離心20 min。上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液經用截留分子量1000 Da的透析袋透析48 h后，凍干處理即可得到兩種非金屬(N, S)同時摻雜的碳點固體粉末，稱重并分散于超純水中，即可得到質量濃度為2 mg·mL?1的碳點分散液。

4.3 紫外-可見吸收及熒光光譜測試

將2 mg·mL?1的碳點分散液稀釋10倍，測試其紫外-可見吸收光譜。設定激發和發射狹縫為5 nm，在350 nm–440 nm激發波長范圍內，每隔20–30 nm測試熒光發射光譜。

4.4 熒光量子產率測定

(1) 分別取硫酸奎寧、碳點溶液于比色皿，測定其紫外吸收光譜，記錄硫酸奎寧、碳點在380 nm處的吸光度值(AR和A)，確保該吸光度值小于0.05。(2) 以380 nm為激發波長，在熒光分光光度計上分別獲取硫酸奎寧、碳點在410–600 nm范圍內的積分熒光強度值(IR和I)。

4.5 熒光檢測Cys

取7支離心管，向其中依次加入100 μL碳點(2 mg·mL?1)、500 μL PBS (20 mmol·L?1，pH 6.0)以及20 μL Cu2+(2.5 mmol·L?1)，渦旋混勻。在室溫下反應5 min后，再向其中分別加入10 μL不同濃度(0、1 × 10?5、1 × 10?4、2 × 10?4、4 × 10?4、7 × 10?4、1.1 × 10?3mol·L?1) Cys，之后用超純水補充至體積為1000 μL，渦旋混勻靜置1 min，在380 nm激發下掃描其熒光光譜。

5 結果與討論

5.1 碳點的光學性質

圖2a為碳點的紫外-可見吸收及熒光最佳激發與發射光譜圖。從吸收曲線可以看出，所合成的碳點在紫外-可見區有強的吸收，在270 nm附近有特征吸收峰，對應于C＝O鍵的n–π*躍遷[7]。此外，碳點還有對稱的激發和發射光譜，最大激發和發射波長分別位于380 nm和481 nm。圖2b為碳點在不同激發波長下的熒光光譜，可以看出碳點在350–440 nm范圍內有激發波長依賴性行為，即碳點的熒光強度隨著激發波長的增加而不斷降低，而且熒光發射光譜也隨之變化，逐漸紅移，呈現出多元激發、多元發射的光譜特性。

圖2 碳點的光學性質

5.2 碳點的熒光量子產率測定

按照實驗4.5方法測定出硫酸奎寧和碳點的AR和A值以及硫酸奎寧、碳點在410–600 nm范圍內的IR和I。代入下述公式計算得到碳點的熒光量子產率為10%，相關測試數據如表3所示。式中ηR和η為溶劑的折射率，因實驗中硫酸奎寧和碳點的濃度均很低，因此可忽略溶質的影響，折射率視為一致，均為1.33[8]。

表3 碳點在水溶液中的熒光量子產率

5.3 碳點熒光探針檢測Cys

如圖3a所示，在沒有加入Cys時，碳點-Cu2+體系有較弱的熒光，說明Cu2+明顯猝滅了碳點熒光。隨著Cys濃度的增加，碳點-Cu2+的熒光強度顯著增強。根據圖3a，計算出碳點-Cu2+體系在不同濃度Cys中的熒光恢復率F/F0(F0為碳點-Cu2+體系的熒光強度，F為碳點-Cu2+體系中加入Cys后的熒光強度)，并繪制F/F0與Cys濃度的關系曲線。如圖3b所示，隨著Cys溶液濃度增加，F/F0值逐漸增強。通過擬合獲得線性方程Y= 0.032X+ 1.1，相關系數R= 0.9958，說明在該濃度范圍內，碳點恢復的熒光與Cys濃度呈良好的線性關系。根據公式LOD = 3σ/k計算檢測限為8.6 × 10?8mol·L?1(其中LOD為檢測限，σ為測定11次空白溶液的標準偏差值，k為線性方程的斜率)。因此，基于這種熒光強度的變化可實現對Cys的檢測。

圖3 (a) 碳點對不同濃度Cys的熒光光譜圖；(b) F/F0與Cys濃度的關系曲線

6 思考題

(1) 哪些因素會影響碳點的熒光性質？為什么？

(2) 采用參比法測定熒光量子產率時，為什么要求公式中AR和A值要小于0.05？

(3) 碳點納米探針用于生物分子檢測，有何優點？

(4) 相比于熒光淬滅型檢測，碳點熒光“off-on”型檢測有什么優點？

7 實驗教學特點及教學組織運行方式

7.1 實驗特點

(1) 實驗內容綜合性強。本實驗內容結合學科前沿，涉及到多種方法原理和大型儀器的綜合運用：碳點的合成、碳點的紫外及熒光光譜性能測試。通過綜合運用這些方法原理及儀器設備能使學生對所學的大學化學知識融會貫通。

(2) 增強學生的科學研究意識。本實驗內容來源于教師的科研項目成果，通過讓學生參與到實驗所有環節，既能培養學生進行文獻調研獲取信息的能力，同時也能使學生領悟到科學探索和研究的方法，培養了學生獨立、嚴謹的科研態度。

7.2 教學組織運行方式

本實驗是一個涉及碳點的合成、表征及應用等內容的綜合實驗，面向化學專業3年級本科生開設，是一個開放性興趣實驗。實驗采用小班開課方式，每班16人左右，4人一組，實驗學時為16學時。分為三個階段進行。第一階段：實驗前教師引導學生進行文獻調研，要求學生課前先查找資料，熟悉碳點的制備及巰基化合物檢測的背景知識，根據文獻調研結果討論匯報實驗原理及實驗方案，此階段學時數為2學時。第二階段：碳點的制備、熒光量子產率測定以及紫外、熒光光譜表征，此階段需10學時。按照以下學時分配分別完成相應兩個單元實驗。第一單元，碳點制備，計劃學時3學時。碳點制備需在實驗課前一天由學生準備好制備碳點的反應前驅體，在教師指導、示范下讓學生將反應物裝入反應釜，升溫至實驗所需溫度，期間有實驗員老師在實驗室值守(1學時)，特別注意恒溫箱處于正常工作狀態。待溫度降至室溫后，由學生將反應釜移出烘箱，用2個學時進行碳點的純化及冷凍干燥處理，48 h透析期間，學生需每隔約12 h換一次水，在換水約定時間實驗員老師在場。第二單元，碳點的表征部分，計劃7個學時，其中碳點的熒光量子產率測試3學時，紫外-可見吸收光譜及熒光光譜測試各2學時。分兩個小組每組交叉進行兩個單元實驗，分別由兩名教師指導學生實驗。第三階段：碳點檢測Cys，此階段需4學時。實驗教學中，以啟發式引導學習基于熒光探針“off-on”型檢測原理及方法。

8 實驗安全規范培訓

本實驗涉及水熱合成和高速離心分離等操作，有必要專門就此進行有關安全規范培訓。其主要包括以下內容：

(1) 高速離心及使用的相關規范培訓。

離心機使用前必須檢查面板上的各按鈕是否處于規定的位置上，檢查其他部位有無松動及不正常情況；使用前必須檢查離心管是否有裂紋、老化等現象，如有應及時更換；每支試管中放置等量樣品，對稱放入轉鼓內，以免由于重量不均及不對稱放置引起離心機激烈振動；離心機在高速旋轉時切不可打開蓋門；使用完畢，將轉鼓和儀器搽拭干凈，以防試液玷污而產生腐蝕。

(2) 恒溫烘箱相關使用規范。

認真檢查恒溫箱自動控制系統是否正常，嚴禁使用線路老化、存在隱患的溫度傳感器及繼電器的恒溫箱；最好使用具有運行自檢功能的恒溫箱，在發生異常時能夠自動斷電保護。

(3) 有關反應釜使用的相關規范培訓。

認真檢查反應釜，不能存在任何程度的細微裂縫；確保反應釜體下墊片位置正確(凸起面向下)，然后放入聚四氟乙烯襯套和上墊片，先擰緊釜蓋，再用螺桿將釜蓋旋鈕擰緊為止；將反應釜置于烘箱內，要按規定的升溫速率升溫至所需反應溫度(切勿高出反應釜耐壓的安全范圍)；確保反應釜內溫度低于反應體系沸點后，方可打開釜蓋進行后續操作。

9 結語

本文設計了一個分析化學綜合實驗。以混雜生物量為原料，通過水熱法合成了一種非金屬摻雜的熒光碳點。并利用Cu2+可以有效猝滅該碳點的熒光，在加入Cys后，由于Cys與Cu2+的絡合，阻礙了Cu2+對碳點熒光的猝滅，碳點熒光得以恢復。利用這一性質實現了對Cys的“off-on”熒光檢測。實驗緊跟前沿熱點，內容豐富、綜合性強，所制備的碳點應用廣泛，與化工學院多個專業聯系緊密，適合于不同專業的學生。本實驗的開設使學生熟悉了納米材料的制備及表征手段以及生物分子檢測過程的基本研究手段，有助于激發學生的學習興趣和創新能力，培養學生的綜合科研能力。