HPLC法測定乳舒合劑中4種有效成分的含量*

葉良紅，李 艷， 林遠福，劉 霞

(1 重慶市銅梁區中醫院，重慶 402560；2 重慶醫藥高等專科學校，重慶 401331；3 重慶市藥物制劑工程技術研究中心，重慶 401331；4 重慶市綦江區人民醫院，重慶 401420)

非哺乳期乳腺炎(non-puerperal mastitis，NPM)是一類發生在女性非哺乳期、良性、病因不明的非特異性炎癥性疾病。其臨床表現多樣，包括非周期性乳房疼痛、乳暈腫塊、乳頭溢液、反復乳頭瘺管形成乳房膿腫等。該病雖然屬于炎癥性疾病，但服用抗生素治療效果不佳[1]，而手術治療后復發概率大。體外抑菌實驗發現，大黃、黃芩[2]、魚腥草[3]、蒲公英等對大腸桿菌O8，連翹[4]、黃柏、蒼耳子等對金黃色葡萄球菌C3-55901有明顯的抑菌作用，因此目前已有一些中藥制劑在急性乳腺炎治療方面發揮了作用，但針對NPM的還較少。

乳舒合劑為醫院協定處方，是由中藥連翹、王不留行、黃芩、梔子經提取制成的中藥復方制劑，具有清熱解毒，通乳消腫的功效，臨床用于NPM效果佳。為了監測院內制劑乳舒合劑的質量，我們建立了高效液相色譜法同時測定該制劑中梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷的含量，所得分析方法靈敏、準確，為該品種的質量控制和評價指標提供依據，為醫院應用傳統中藥制劑實施備案管理[5]做好前期研究基礎。

1 儀器與試藥

美國Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站)；瑞士梅特勒MS105DU十萬分之一電子天平。

連翹苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110821-201816，含量：95.1%);黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201821，含量：95.4%);梔子苷對照品(成都普菲德生物技術有限公司，批號：19101705，含量：99.1%);王不留行黃酮苷對照品(成都普菲德生物技術有限公司，批號：19031203，含量：98.0%)；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，實驗用水為超純水；連翹(廣東瑞博制藥有限公司，批號：190801);黃芩(廣東匯群中藥飲片股份有限公司，批號：20190401);梔子(康美藥業股份有限公司，批號：190305201);王不留行(康美亳州世紀國藥有限公司，批號：190100039)，經湖南省食品藥品檢驗研究院中藥室梁晟副主任藥師鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters sunfire C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，0.3%磷酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫，見表1；流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：238 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.2 系統適用性試驗

取梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷對照品各適量，加甲醇溶解，稀釋制成每1 mL中各約含40 μg的溶液，作為系統適用性溶液。按2.1項下色譜條件測定，得到各色譜峰峰形較好，分離度均大于1.5，符合中國藥典要求，系統適用性良好，色譜圖見圖1。

圖1 系統適用性試驗色譜圖Fig.1 Chromatogram of system suitability test

2.3 溶液的制備

(1)對照品溶液。取梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷對照品各適量，加甲醇溶解，分別稀釋制成每1 mL中約含梔子苷0.1 mg、王不留行黃酮苷0.04 mg、黃芩苷0.08 mg、連翹苷0.04 mg的溶液；

(2)供試品溶液。根據醫院制劑處方組成，取連翹12 g、王不留行9 g、梔子6 g、黃芩6 g，第一次加水600 mL小火煎煮30 min，倒出煎液，第二次加水400 mL煎煮20 min，倒出煎液，第三次加水200 mL煎煮10 min，合并三次煎液，過濾，濾液干燥濃縮至約60 mL，濃縮液加甲醇稀釋至100 mL，精密量取5 mL，加甲醇稀釋至50 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液。按照2.1色譜條件，取各對照品溶液、供試品溶液各20 μL進樣，得到色譜圖見圖2。

圖2 對照品溶液和供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms of the reference solution and the test solution

2.4 精密度考察

精密吸取2.2項下的各對照品溶液20 μL，重復進樣6次，測得梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷峰面積RSD分別為0.87%、1.12%、1.05%、1.24%，表明儀器精密度良好。

2.5 線性關系考察

精密稱取梔子苷對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成0.051 μg·mL-1、0.255 μg·mL-1、1.275 μg·mL-1、5.1 μg·mL-1，25.5 μg·mL-1、102 μg·mL-1系列濃度溶液；精密量取王不留行黃酮苷對照品溶液適量，用甲醇溶解稀釋制成0.107 μg·mL-1、0.214 μg·mL-1、0.535 μg·mL-1、2.14 μg·mL-1、10.7 μg·mL-1、42.8 μg·mL-1系列濃度溶液；精密稱取黃芩苷對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成0.072 μg·mL-1、0.36 μg·mL-1、1.8 μg·mL-1、7.2 μg·mL-1，28.8 μg·mL-1、72 μg·mL-1系列濃度溶液；精密量取連翹苷對照品溶液適量，用甲醇溶解稀釋制成0.093 μg·mL-1、0.186 μg·mL-1、0.465 μg·mL-1、1.86 μg·mL-1、9.3 μg·mL-1、37.2 μg·mL-1系列濃度溶液。進樣，記錄色譜圖，以對照品溶液峰面積(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線。得梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷回歸方程分別為：

Y=30211X+7167，r=0.9992，n=6

Y=19774X-3191，r=0.9994，n=6

Y=29659X-16132，r=0.9990，n=6

Y=21793X-4857，r=0.9996，n=6

結果顯示，梔子苷在0.051～102 μg·mL-1范圍內線性關系良好，王不留行黃酮苷在0.107～42.8 μg·mL-1范圍內線性關系良好，黃芩苷在0.072～72 μg·mL-1范圍內線性關系良好，連翹苷在0.093～37.2 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.6 穩定性考察

取供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，依法測定，測得梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷的峰面積RSD分別為1.16%、0.78%、1.37%、1.43%，表明供試品在12 h內穩定。

2.7 定量限和檢測限

取2.2項下梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷對照品溶液，分別逐級稀釋，按2.1項下色譜條件測定，直至峰高信噪比S/N約為10時作為定量限濃度，信噪比S/N約為3時作為檢測限濃度。結果表明梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷定量限分別為0.051 μg·mL-1、0.11 μg·mL-1、0.072 μg·mL-1、0.093 μg·mL-1，檢測限分別為0.015 μg·mL-1、0.033 μg·mL-1、0.022 μg·mL-1、0.028 μg·mL-1。

2.8 回收率試驗

取相當于供試品含量80%(低組)、100%(中組)、120%(高組)的梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷對照品各3份，同2.3項下供試品溶液的制備方法處理，測定加樣回收率，結果見表2。

表2 回收率試驗Table 2 Recovery rate test

2.9 含量測定

取1.2項下藥材，制備乳舒合劑，按2.1項下色譜條件測定，測得每劑(連翹12 g、王不留行9 g、梔子6 g、黃芩6 g)中含連翹苷9.27 mg、王不留行黃酮苷24.8 mg、梔子苷433 mg、黃芩苷74.3 mg。在測定梔子苷含量時，由于其含量比連翹苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷含量多，需將樣品稀釋至梔子苷線性范圍內的濃度后再進樣，以保證結果的準確性。

3 討 論

3.1 波長的選擇

《中國藥典》2020年版中連翹苷、王不留行黃酮苷、梔子苷、黃芩苷測定波長分別為277 nm、280 nm、238 nm、280 nm[6]，本實驗通過二極管陣列檢測器掃描，得到連翹苷、王不留行黃酮苷、梔子苷、黃芩苷最大吸收波長分別為229 nm、336 nm、239 nm、277 nm，同時監測277、254、238 nm三個波長的色譜圖，結果顯示4個成分在238 nm處均有較好的響應。綜合考慮4個成分的紫外吸收強度及溶劑末端吸收等因素，最終確定測定波長為238 nm。

3.2 流動相及梯度洗脫程序

試驗中考察了以甲醇和乙腈為流動相的有機相，梔子苷、王不留行黃酮苷極性相對較大，較易洗出，有機溶劑比例應較小，黃芩苷和連翹苷極性相對較小，較難洗出，應增加有機溶劑比例。綜合考察洗脫時間、峰形、分離度、靈敏度，最終確定以乙腈為有機相，0.3%磷酸為水相，有機相比例從10%逐漸增至30%。

3.3 樣品測定

連翹苷、王不留行黃酮苷、梔子苷、黃芩苷為中藥連翹、王不留行、梔子、黃芩的主要有效成分，因此本研究著重考察此4個成分的含量。試驗測得乳舒合劑樣品中成分含量由多至少的順序為梔子苷、黃芩苷、王不留行黃酮苷、連翹苷，除了跟藥材本身有效成分含量有關，還可能跟樣品制備過程采用水煎法有關系，梔子苷相對極性較大，較易煎出，連翹苷極性相對較小，較難煎出。本研究下一步工作擬采用醇提法制備乳舒合劑，并將結果與水煎法進行比較，以進一步優化制劑工藝，提高產品質量。

4 結 論

國家食品藥品監督管理總局于2018年2月發布公告，對醫療機構應用傳統工藝配制中藥制劑實施備案管理。公告中明確指出，醫療機構要對其配制的中藥制劑實施嚴格的質量管理。備案資料中包括配制工藝及工藝研究資料、質量研究的試驗資料及文獻、制劑內控標準及起草說明等諸多內容。乳舒合劑為醫院協定處方，臨床用于非哺乳期乳腺炎效果較好。研究團隊經過試驗表明，本文建立的HPLC法適用于測定本院制劑乳舒合劑中梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷的含量，可以為該品種實施備案管理積累質量研究試驗資料，同時對其他含有梔子苷、王不留行黃酮苷、黃芩苷、連翹苷的中藥制劑進行質量監控具有一定參考價值。