HPLC-MS/MS法測定美金剛體內(nèi)濃度及藥代動力學(xué)研究*

張 聰，林 霞，楊子毅

(江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，俗稱早老性癡呆、老年癡呆，是一種漸進性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙和日常生活能力下降[1]，是造成癡呆的主要原因之一[2-3]。鹽酸美金剛(Memantine Hydrochloride，MEM·HCl)是唯一上市的NMDA受體拮抗劑，也是唯一一個用于治療中重度阿爾茨海默癥的藥物，也有研究表明其與多奈哌齊聯(lián)用能改善患者的認(rèn)知功能[4-8]。鹽酸美金剛(圖1)是一種低中親和力、非競爭性、強電壓依賴性的 NMDA 受體拮抗劑，其通過阻斷谷氨酸(Glu)引起的 NMDA 受體過度興奮，從而間接抑制β-淀粉樣蛋白的作用阻止細(xì)胞凋亡和阿爾茨海默癥的病程，能改善患者的認(rèn)知功能。本項目采用難溶性鹽和納米晶體技術(shù)開發(fā)了一種美金剛雙羥萘酸鹽混懸劑。

因為美金剛無紫外吸收，所以其含量只能采用柱前衍生化或者質(zhì)譜來測定，但由于柱前衍生化操作復(fù)雜，且定量限過高，血漿中的樣品濃度過低，所以不適合柱前衍生化方法；本項目采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜來測定血漿樣品中美金剛的含量，現(xiàn)有的測定方法樣品前處理大多采用液液萃取的方式，該方式用于測定美金剛的含量提取回收率不穩(wěn)定，且中間環(huán)節(jié)過多，容易造成樣本污染，實驗操作過于繁雜，因此，急需建立一種前處理方式簡便快捷，方法可靠的血漿中美金剛的含量測定方法。

圖1 鹽酸美金剛結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of memantine hydrochloride

本項目采用沉淀蛋白法進行血漿樣品前處理，操作簡便；并對超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行了方法學(xué)驗證，結(jié)果顯示我們所開發(fā)的方法是可行的。將我們所制備的美金剛雙羥萘酸鹽混懸劑進行藥代動力學(xué)研究，結(jié)果顯示其在大鼠體內(nèi)成功緩釋7天，為以后的美金剛長效注射劑的開發(fā)提供了一定的參考。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

BSA 124S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；100 μL和200 μL量程移液槍，德國Eppendorf 公司； Centrifuge 5424 R冷凍低溫離心機，德國Eppendorf公司；LGJ-15E冷凍干燥機，北京四環(huán)科技儀器廠有限公司；渦旋，SCILOGEX MX-S公司；Minifer臥式納米研磨機，德國耐馳儀器制造有限公司；MSMS-8045三重四級桿質(zhì)譜檢測器，日本島津公司。

鹽酸美金剛，湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司；雙羥萘酸，廣東翁江化學(xué)試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉 7L2P，Ashland化工有限公司；聚山梨酯80，南京威爾化工有限公司；甘露糖醇，山河藥輔；色譜純甲醇，賽默飛世爾科技有限公司；其余所用試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；實驗所用水為蒸餾水，流動相所用水為純化水。

1.2 試驗方法

1.2.1 美金剛雙羥萘酸鹽的制備

該難溶性鹽是采用沉淀法制備的。準(zhǔn)確稱量0.12 mol的雙羥萘酸，混懸于320 mL水中，于60 ℃，800 rpm攪拌，然后緩慢滴加80 mL 3 mol/L氫氧化鈉水溶液(雙羥萘酸與氫氧化鈉的摩爾比為1:2)。當(dāng)NaOH溶液滴加完全后，繼續(xù)攪拌5 min，超聲5 min。若仍有不溶性沉淀物，繼續(xù)于60 ℃，800 rpm下滴加NaOH溶液，直至雙羥萘酸完全溶解，即可得到約為0.3 mol/L(實際濃度根據(jù)滴加體積計算)的雙羥萘酸二鈉水溶液。配制0.08 mol/L鹽酸美金剛水溶液，在使用玻璃棒攪拌的情況下，將雙羥萘酸二鈉水溶液滴加入鹽酸美金剛水溶液(鹽酸美金剛與雙羥萘酸的摩爾比為2:1)。美金剛雙羥萘酸鹽從溶液中析出，抽濾，水洗至濾液呈中性，收集濾餅，在50 ℃真空干燥箱中干燥18 h。

1.2.2 美金剛雙羥萘酸鹽混懸劑的制備

首先配制分散介質(zhì)，稱量羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)1%，NaH2PO4·2H2O 0.25%，Na2HPO40.5%，甘露醇5%，加入至相對于量的水中，攪拌至溶解，用1 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH 至7.4。準(zhǔn)確稱量13.0 g美金剛雙羥萘酸鹽，在200 rpm的速率少量多次加入250 mL分散介質(zhì)中。加入完全后，繼續(xù)攪拌1 h，使用介質(zhì)研磨機進行研磨，研磨介質(zhì)為0.8 μm的氧化鋯珠，轉(zhuǎn)速為2500 rpm，泵速為4檔，氣壓為4.0～4.5 bar，研磨時間為2 min。研磨完成后將其分裝倒入西林瓶進行冷凍干燥后儲存，每個西林瓶里含有2.0 mL研磨液。

1.2.3 給藥方案與血漿樣品采集

采用肌肉注射方式給藥，給藥前制劑用0.5 mL的超純水復(fù)溶，給藥劑量為125 mg/kg(以美金剛計)。給藥前給大鼠稱重，根據(jù)大鼠體重和制劑的實際含量確定最終給藥體積。分別在給藥后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d和17 d使用毛細(xì)管于眼底靜脈叢取血約0.3 mL，置于預(yù)先肝素化的1.5 mL尖底離心管中，4000 rpm離心10 min，移取上層血漿于未肝素化離心管中，置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血漿樣品的處理

(1)內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取昂丹司瓊0.12 g置于100 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，冷卻至室溫后，用甲醇定容至刻度線。用移液管吸取1 mL上述溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，再用移液管準(zhǔn)確量取1 mL上述溶液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，即得濃度為200 ng/mL的昂丹司瓊內(nèi)標(biāo)溶液。

(2)血漿樣品處理：取100 μL血漿、20 μL昂丹司瓊甲醇溶液(內(nèi)標(biāo)，IS，200 ng/mL)和520 μL甲醇加入至1.5 mL EP管中，渦旋10 min。然后12000 rpm離心10 min。取上清液200 μL，再以12000 rpm離心10 min。取上清液100 μL，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)進行分析，測定其中美金剛的含量。

1.2.5 美金剛體內(nèi)樣品分析方法學(xué)的建立

1.2.5.1 色譜條件

美金剛的分離使用Shim-pack GIST C18色譜柱(2.1 I.D.×50 mm)，柱溫35 ℃，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL，進樣時間8 min。采用梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。

表1 美金剛UHPLC梯度洗脫流動相方法Table 1 UHPLC gradient elution mobile phase ofmemantine

1.2.5.2 質(zhì)譜條件

采用三重四極質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI 源)，正離子方式檢測；美金剛和IS的定量選擇多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。美金剛選擇的前體離子為180.0000，產(chǎn)物為163.100，Q1 Pre偏差為-12.0 V，CE為-15.0 V，Q3 Pre偏差為-18.0 V。內(nèi)標(biāo)昂丹司瓊的前體離子為294.3678，產(chǎn)物為170.0500，CE為-27.0 V。駐留時間都是100 msec。

1.2.5.3 專屬性實驗

取空白血漿、空白血漿混合含藥和內(nèi)標(biāo)溶液、血漿樣品，按“血漿樣品處理”方法處理后進行HPLC-MS/MS分析。

1.2.5.4 線性和定量限實驗

配制濃度為1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL的美金剛甲醇溶液，在1.5 mL離心管中依次加入內(nèi)標(biāo)IS溶液(200 ng/mL)20 μL，各濃度藥物溶液20 μL，空白血漿100 μL，按“血漿樣品處理”方法處理后進行HPLC-MS/MS分析。

1.2.5.5 準(zhǔn)確度與精密度實驗

選取2 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL分別為低、中、高QC濃度，在1.5 mL離心管中依次加入內(nèi)標(biāo)IS溶液(200 ng/mL)20 μL，各濃度藥物溶液20 μL，空白血漿100 μL，按“血漿樣品處理”方法處理后進行HPLC-MS/MS分析。

1.2.5.6 提取回收率實驗

選取2 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL分別為低、中、高QC濃度。

(1)在1.5 mL離心管中依次加入內(nèi)標(biāo)IS溶液(200 ng/mL)20 μL，各濃度藥物溶液20 μL，空白血漿100 μL，按“血漿樣品處理”方法處理后進行HPLC-MS/MS分析。

(2)在1.5 mL離心管中加入空白血漿100 μL，甲醇500 μL，渦旋10 min，12000 rpm離心10 min；取全部上清液，加入內(nèi)標(biāo)IS溶液(200 ng/ml)20 μL，各濃度藥物溶液20 μL，12000 rpm離心10 min；取100 μL上清液進行HPLC-MS/MS分析。

1.2.5.7 基質(zhì)效應(yīng)

選取2 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL分別為低、中、高QC濃度。

(1)在1.5 mL離心管中依次加入內(nèi)標(biāo)IS溶液(200 ng/mL)20 μL，各濃度藥物溶液20 μL，空白血漿100 μL，按“血漿樣品處理”方法處理后進行HPLC-MS/MS分析。

(2)將血漿替換成甲醇，按“血漿樣品處理”方法處理后進行HPLC-MS/MS分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

藥代動力學(xué)參數(shù)用Phoenix 64軟件計算，采用非房室法處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 專屬性

圖2 樣品的 UPLC-MS/UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC MS/UPLC of blank plasma

如圖2所示，美金剛和 IS 的保留時間分別約為3.940 min 和 3.257 min 。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾美金剛的測定，方法專屬性高。

2.1.2 線性與定量限

實際配制的線性溶液濃度為: 美金剛505.6 ng/mL、252.8 ng/mL、101.1 ng/mL、50.56 ng/mL、20.22 ng/mL、10.11 ng/mL、5.056 ng/mL、2.022 ng/mL、1.011 ng/mL，以美金剛質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，美金剛與IS(200 ng/mL昂丹司瓊)峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(1/X2)最小二乘法進行回歸運算，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。經(jīng)計算可知，血漿中美金剛的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y=0.0581x+0.0087。標(biāo)準(zhǔn)曲線中R>0.99，符合要求，美金剛的線性范圍是1.011～505.6 ng/mL，定量下限為1.011 ng/mL。

2.1.3 準(zhǔn)確度與精密度

結(jié)果顯示，低、中、高濃度QC樣品的精密度(RSD)分別為13.26%、6.41% 和5.18%；準(zhǔn)確度分別為118.59%、111.20%和102.50%，低濃度樣品測定結(jié)果均在80%～120%內(nèi)，中、高濃度樣品測定結(jié)果均在85%～115%內(nèi)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.4 提取回收率

以每一質(zhì)量濃度2種處理方法峰面積之比計算提取回收率，在低、中、高質(zhì)量濃度下美金剛提取回收率分別為(65.08±12.51)%、(80.17±12.15)%和(86.55±5.00)%，符合要求。

2.1.5 基質(zhì)效應(yīng)

以每一質(zhì)量濃度2種處理方法峰面積之比計算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示，在低、中、高質(zhì)量濃度下美金剛基質(zhì)效應(yīng)為93.70%±12.51%、100.03%±12.15%和98.19%±5.00%，在85%～115%內(nèi)，表明SD大鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)對美金剛的測定基本無干擾。

2.2 美金剛雙羥萘酸鹽混懸劑的藥代動力學(xué)

表2 美金剛雙羥萘酸鹽混懸劑的主要藥動學(xué)參數(shù)Table 2 Main pharmacokinetic parameters of memantine pamoic acid suspension n=6)

圖3 美金剛雙羥萘酸鹽混懸劑的血藥濃度-時間曲線

Fig.3 The plasma concentration-time profiles ofmemantine pamoic acid suspension n=6)

由表2可知，該混懸劑經(jīng)肌肉注射后在大鼠體內(nèi)的Tmax為0.25 d，Cmax為434.4 ng/mL,由圖3的血藥濃度-時間曲線可知，我們所制備的長效注射劑在大鼠體內(nèi)獲得了緩釋7天的效果，并且在17天還能檢測到美金剛，證明該制劑作為長效注射劑是有潛力的。

3 結(jié) 論

本研究通過沉淀蛋白和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿樣品中美金剛的濃度，并進行方法學(xué)驗證和藥代動力學(xué)考察。結(jié)果表明該方法專屬性強、靈敏度高，結(jié)果可靠，可以用于測定血漿中美金剛的含量，并且根據(jù)藥動學(xué)結(jié)果，我們所制備的美金剛雙羥萘酸鹽混懸劑在大鼠體內(nèi)成功緩釋7天，為之后的美金剛長效注射劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。