黃體酮陰道緩釋凝膠的處方及工藝的研究*

吳雪青，余 倩，林 霞，楊子毅

(江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

黃體酮(Progesterone)是由卵巢、胎盤和腎上腺分泌的一種天然孕激素，在臨床上主要用于治療先兆性流產(chǎn)、黃體功能不全以及用于胚胎移植后的輔助生育等[1]。黃體酮主要通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，降低子宮平滑肌的興奮性，促進(jìn)母-胎界面的免疫耐受以保護(hù)受精卵和胎兒[2]。目前市售黃體酮主要以口服，肌肉注射和陰道制劑為主。黃體酮經(jīng)口服由于溶解度低和肝臟首過(guò)效應(yīng)，導(dǎo)致其生物利用度低，臨床治療效果較差[3]。肌肉注射制劑為油溶性注射液會(huì)引起強(qiáng)烈疼痛，且長(zhǎng)期注射會(huì)引起注射部位過(guò)敏反應(yīng)以及形成無(wú)菌膿腫[4]。與口服和注射相比，陰道遞送黃體酮具有更高的生物利用度和患者依從性。

陰道給藥是局部和全身靶向治療的有效途徑，具有比表面積大、血液供應(yīng)豐富以及避免肝臟首過(guò)效應(yīng)等優(yōu)勢(shì)。Miles等[5]發(fā)現(xiàn)相比于肌肉注射黃體酮，陰道給予黃體酮后雖然血漿中黃體酮水平低，但子宮組織中的黃體酮水平相比而言更高，藥物實(shí)現(xiàn)了直接從陰道遞送到子宮，即子宮首過(guò)效應(yīng)。由于陰道的自我清潔作用以及重力的存在，陰道制劑的吸收以及滯留時(shí)間往往不能達(dá)到預(yù)期。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，生物粘附性聚合物和納米技術(shù)逐漸應(yīng)用于陰道遞送系統(tǒng)[6-7]。

黃體酮陰道緩釋凝膠，商品名為雪諾同(Crinone?)是一種水包油乳劑，其中微粉化的黃體酮大部分分散在油相中形成藥物儲(chǔ)庫(kù)，由卡波姆和聚卡波非組成的生物粘附性聚合物可以在陰道滯留72 h以上，因此在陰道給藥后可以實(shí)現(xiàn)持續(xù)的藥物釋放。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)黃體酮陰道緩釋凝膠的仿制藥上市，因此本實(shí)驗(yàn)考察了黃體酮陰道緩釋凝膠的處方工藝，由于處方中關(guān)鍵輔料氫化棕櫚油甘油酯在CDE上并無(wú)登記備案，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素考察篩選出可以替代的脂質(zhì)輔料，并采用單因素及因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響藥物體外溶出的處方因素進(jìn)行研究，以優(yōu)化處方。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

BSA124S分析天平，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；R18頂置式攪拌器，德國(guó)CAT公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州科泰試驗(yàn)設(shè)備有限公司；Hybrid Discovery HR-3流變儀，美國(guó)TA公司；RC-806D智能溶出儀，天津天大天發(fā)有限公司；ZB-1G智能崩解儀，天津海益達(dá)科技有限公司；XSP-2CA光學(xué)顯微鏡，上海光學(xué)儀器六廠；FE20pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；TG16-WS高速離心機(jī)，上海盧湘儀儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

黃體酮、微粉化黃體酮，湖北葛店人福藥業(yè)有限公司(純度：99.8%)；黃體酮陰道緩釋凝膠，市售制劑(規(guī)格：90 mg/支，批號(hào)：C18151Y/C，F(xiàn)leet Laboratories Ltd)；脂質(zhì)(CeleolTMMono and DiglyceridesNF、Suppocire?A、Suppocire?CM、Suppocire?DM、Suppocire?BM、Suppocire?AM、CetylPalmitate)，法國(guó)嘉法獅；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃體酮陰道緩釋凝膠的制備

根據(jù)相關(guān)專利我們得到了黃體酮陰道緩釋凝膠的處方組成與制備工藝[8]。制備工藝如下：①聚合物相制備：將山梨酸溶液于75～78 ℃溶解完全，待冷卻至室溫后依次加入卡波姆、聚卡波非，混合2～3 h，加入微粉化黃體酮攪拌均勻；②油相制備：將甘油、液體石蠟、氫化棕櫚油甘油酯加熱熔融，攪拌均勻，冷卻至60 ℃；③乳化：將油相加入至聚合物相中，攪拌均勻。由于具體工藝參數(shù)并不完整，故對(duì)其制備工藝進(jìn)行進(jìn)一步考察。

1.2.2 黃體酮陰道緩釋凝膠的處方體外評(píng)價(jià)

(1)外觀性狀

將樣品涂抹于載玻片上進(jìn)行觀察，觀察樣品的顏色與細(xì)膩程度，觀察其在顯微鏡下的藥物形態(tài)與乳滴粒度，根據(jù)《中國(guó)藥典2020版》規(guī)定凝膠劑不得檢出大于180 μm的粒子[9]。

(2)流變學(xué)

使用HR-3流變儀分別在剪切模式和震蕩模式下進(jìn)行考察[10]。在25 ℃，F(xiàn)low模式下，剪切速率從0.1增加至100 s-1，記錄不同剪切速率下的動(dòng)態(tài)粘度，同時(shí)測(cè)定在固定剪切速度6 rad/s下樣品的粘度，平行三份。在25 ℃振蕩模式下評(píng)估制劑的粘彈性。施加15 Pa的恒定壓力，在0.1～10 Hz的范圍內(nèi)進(jìn)行掃頻分析。記錄儲(chǔ)能模量(G’)，損耗模量(G”)和損耗角正切(tanδ)，平行三份。

(3)pH

直接使用pH計(jì)測(cè)定樣品的pH，同時(shí)參考《膠粘劑的pH值測(cè)定》中的測(cè)定方法，取1 g樣品加入經(jīng)煮沸冷卻后的蒸餾水10 mL，并不斷攪拌至均勻后，用pH計(jì)測(cè)定。

(4)穩(wěn)定性

進(jìn)行樣品的離心穩(wěn)定性和耐熱穩(wěn)定性考察。分別將樣品于55 ℃、70 ℃放置24 h，觀察樣品外觀形態(tài)發(fā)生變化；分別將樣品與3000 r、5000 r、8000 r離心30 min，觀察樣品外觀形態(tài)發(fā)生變化。

(5)體外溶出

采用高效液相色譜法測(cè)定藥物濃度并計(jì)算溶出度。色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相為：甲醇:乙腈:水=35:40:25(v/v)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：241 nm；柱溫：30 ℃。

參考FDA公布的相關(guān)文件，黃體酮陰道緩釋凝膠的體外溶出采用藥典第一法(籃法)裝置，溶出介質(zhì)為1000 mL 20%甲醇-水，溫度為(37±1) ℃，轉(zhuǎn)速100 rpm。將100 mg±2%的制劑置于0.45 μm微孔濾膜中央，將膜固定于轉(zhuǎn)籃底部，于5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h取樣，樣品過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾，采用HPLC法測(cè)定溶出樣品的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃體酮陰道緩釋凝膠制備工藝的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外觀性狀的觀察以及流變學(xué)研究考察等篩選一系列工藝參數(shù)。

2.1.1 黃體酮的加入方式

考察將黃體酮分別加入聚合物凝膠中、加入油相中、加入山梨酸水溶液中、加入空白的乳液凝膠中對(duì)處方的影響。結(jié)果顯示，黃體酮先加入聚合物相，再與油相混合乳化，所制得的制劑較其他加入方式更為細(xì)膩。

2.1.2 乳化設(shè)備

考察使用頂置式攪拌器、高剪切、帶刮壁旋槳攪拌器三種不同乳化設(shè)備對(duì)處方的影響。考慮到所制得凝膠的的外觀性狀以及制備工藝的方便，乳化設(shè)備選擇頂置式攪拌器。

2.1.3 聚合物溶脹時(shí)間

考察將聚合物分別溶脹至恰好分散完全、溶脹2 h以及溶脹12 h對(duì)處方的影響。卡波姆和聚卡波非溶脹2 h與過(guò)夜溶脹12 h其流動(dòng)性差別較大，溶脹時(shí)間為2 h與原研制劑較為相似，進(jìn)一步考察了聚合物凝膠溶脹1.5 h、2 h、2.5 h與3 h時(shí)其流變學(xué)行為，由圖1可知其流變學(xué)行為并無(wú)顯著差異，考慮到溶脹時(shí)間過(guò)短，凝膠容易出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，故選擇溶脹時(shí)間為2 h。

圖1 不同溶脹時(shí)間的凝膠在6 rad/s的剪切速度下的粘度Fig.1 Viscosity of gel with different swelling time at 6 rad/s

2.1.4 凝膠pH

考察pH調(diào)節(jié)劑氫氧化鈉的加入順序，即在加藥乳化前調(diào)節(jié)pH與在乳化后調(diào)節(jié)pH對(duì)處方的影響。凝膠pH在加藥乳化前或者乳化后進(jìn)行調(diào)節(jié)并無(wú)明顯差別，考慮到pH計(jì)的使用會(huì)產(chǎn)生樣品的損耗，故選擇在加藥乳化前進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。考慮到市售制劑的pH為3左右，且陰道的pH環(huán)境在3～4之間，故設(shè)定凝膠pH值在3.0±0.1[11]。

表1 黃體酮陰道緩釋凝膠自制制劑工藝參數(shù)及外觀Table 1 Technical parameters and appearance of self-preparations of progesterone sustained-release vaginal gel

2.2 黃體酮陰道緩釋凝膠處方因素對(duì)體外溶出的影響

2.2.1 原料藥粒徑對(duì)體外溶出的影響

圖2 不同粒徑原料藥對(duì)體外溶出的影響(n=3)Fig.2 Effectof different particle size of progesterone on drug in vitro release(n=3)

使用D90為200 μm左右的黃體酮粗粉進(jìn)行氣流粉粹，分別得到D90為17 μm、27 μm、38 μm、49 μm的原料藥，并分別使用200、100目使用篩網(wǎng)截留得到75 μm、150 μm的原料藥。其他條件不變的情況下，考察不同原料藥粒徑(小于10 μm、17 μm、27 μm、38 μm、49 μm、75 μm、150 μm)所制備的制劑對(duì)體外溶出的影響。由圖2結(jié)果可知原料藥粒徑對(duì)黃體酮陰道緩釋凝膠的體外釋放有著顯著的影響，隨著粒徑的增加，藥物釋放逐漸放緩。

2.2.2 析因法考察處方中關(guān)鍵輔料對(duì)體外溶出的影響

已有文獻(xiàn)報(bào)道，影響黃體酮粘度的主要處方因素為甘油和聚卡波非[12]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察影響黃體酮陰道緩釋凝膠體外溶出的處方因素。選擇聚卡波非用量(A)、脂質(zhì)用量(B)、甘油用量(C)和原料藥粒徑(D)4 個(gè)因子，進(jìn)行部分析因設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。以相似因子f2為響應(yīng)因子，通過(guò)Minitab進(jìn)行效應(yīng)分析，由圖3可知甘油、粒徑以及聚卡波非與粒徑的交互作用顯著影響黃體酮緩釋凝膠的體外釋放。

表2 DOE實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factor and level of DOE design

圖3 效應(yīng)分析pareto圖Fig.3 Paretoof effect analysis

2.2.3 單因素法考察處方中關(guān)鍵輔料對(duì)體外溶出的影響

對(duì)處方中各關(guān)鍵輔料用量進(jìn)行單因素考察，由圖4結(jié)果可知，各輔料用量對(duì)藥物溶出均有影響，但并無(wú)明顯規(guī)律。通過(guò)相似因子的比較得到了較優(yōu)的處方組成：1%脂質(zhì)、12.9%甘油、4.2%液體石蠟、2%聚卡波非、1%卡波姆、0.08%山梨酸、8%黃體酮。

圖4 處方中關(guān)鍵輔料對(duì)體外溶出的影響(n=3)Fig.4 Effectof different particle size of progesterone on drug in vitro release(n=3)

2.2.4 不同脂質(zhì)型號(hào)對(duì)體外溶出的影響

對(duì)不同型號(hào)的脂質(zhì)(CeleolTM Mono and DiglyceridesNF、Suppocire?A、Suppocire?CM、Suppocire?DM、Suppocire?BM、Suppocire?AM、Cetyl Palmitate)所制備的處方進(jìn)行體外溶出考察，以與市售制劑Crinone?溶出曲線(n=6)的相似因子f2為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。這些不同型號(hào)的脂質(zhì)脂質(zhì)主要存在熔點(diǎn)差異，不同的理化性質(zhì)會(huì)影響脂質(zhì)在制劑內(nèi)的存在形式。結(jié)果如圖5所示，CetylPalmitate所制備的處方溶出曲線相似因子f2=64.23大于其他脂質(zhì)。

圖5 不同型號(hào)脂質(zhì)對(duì)體外溶出的影響(n=3)Fig.5 Effect of different type of lipid on in vitro drug release(n=3)

2.3 最優(yōu)處方的制備以及評(píng)價(jià)

2.3.1 優(yōu)化后的制備工藝

最終優(yōu)化后的制備工藝：①聚合物相制備：將處方量的水與山梨酸加熱至75 ℃溶解完全，帶冷卻至室溫后依次加入卡波姆、聚卡波非，800 rpm四葉槳攪拌2 h，用1 M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至3.0±0.1，并將微粉化的黃體酮加入聚合物相中攪拌均勻，加熱至60 ℃；②油相制備：將甘油、液體石蠟、脂質(zhì)加熱熔融，攪拌均勻，并于60 ℃保溫；③乳化：將油相加入至聚合物相中，于60 ℃ 400 rpm乳化30 min。

2.3.2 優(yōu)化后的處方組成及用量

通過(guò)單因素法考察，確定了處方比例，優(yōu)化了脂質(zhì)的種類，具體的處方組成及用量如表3所示。

表3 處方組成及用量Table 3 Component and amount of formulation

2.3.3 最優(yōu)處方的評(píng)價(jià)

根據(jù)上述優(yōu)化后的處方及工藝，制備黃體酮陰道緩釋凝膠。制劑外觀細(xì)膩光滑，顯微鏡下無(wú)大于180 μm的粒子存在。離心穩(wěn)定性良好，8000 rpm，離心30 min不分層。耐熱穩(wěn)定性良好，70 ℃放置24 h不分層。流變學(xué)結(jié)果如圖6所示，自制制劑粘度與市售制劑接近，市售制劑與自制制劑的儲(chǔ)能模量G’>損耗模量G”，說(shuō)明制劑均具有粘彈性。如圖7所示，自制制劑體外溶出曲線的相似因子f2=64.23，與市售制劑Crinone?釋放行為基本一致。

圖6 自制制劑與市售制劑的流變學(xué)Fig.6 Rheology study on self-made formulation and commercial preparations

圖7 自制制劑(n=3)與市售制劑(n=6)的體外溶出Fig.7 Invitro drug release of the self-made preparation(n=3)and commercial preparations(n=6)

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)單因素考察對(duì)黃體酮陰道緩釋凝膠的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)析因法與單因素法考察影響體外溶出的處方因素，對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化。因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得出處方中甘油、粒徑以及聚卡波非與粒徑的交互作用顯著影響制劑的體外溶出。最優(yōu)處方與市售制劑Crinone?，在外觀性狀、流變學(xué)性質(zhì)及體外溶出行為方面均相似，為后期進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。