冷藏法改善固體分散體溶出樣品穩(wěn)定性研究*

董明明，楊子毅，林 霞

(江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

泊沙康唑(posaconazole)屬于高親脂性第二代抗真菌藥，泊沙康唑是羊毛甾醇14-脫甲基酶的強(qiáng)效抑制劑，而羊毛甾醇14-脫甲基酶是麥角固醇生物合成關(guān)鍵步驟的催化酶，泊沙康唑通過抑制真菌細(xì)胞膜上羊毛甾醇14α-脫甲基酶(CYP51)而產(chǎn)生抗真菌作用[1-4]。泊沙康唑?qū)儆贐CS Ⅱ類藥物，溶解度受pH的影響較大，其在酸性環(huán)境下溶解度較高，但當(dāng)溶解在胃中的泊沙康唑到達(dá)腸道時(shí)，大量已溶解的泊沙康唑沉淀析出，而腸道正是藥物吸收的主要部位，這使泊沙康唑的生物利用度大大降低[5-6]。

熱熔擠出(hot-melt extrusion,HME)技術(shù)通過選擇適宜的高分子載體材料，通過混合、熔融、剪切、擠出，制備成藥物高度分散的固體溶液，以提高藥物的溶解度[7-10]。固體分散體利用高能無定形形式，其溶解度通常比結(jié)晶形式高幾倍。但是，這種溶解度的提高是一種動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，可能會(huì)隨著藥物從溶液中的重結(jié)晶而消失，而藥物接觸溶出介質(zhì)后通常會(huì)加快該過程。據(jù)報(bào)道，更快的溶解速度可以加速溶液過飽和的積累，而過飽和度的增加將進(jìn)一步加速藥物的重結(jié)晶[11]。當(dāng)體外溶出樣品取出時(shí)不一定在第一時(shí)間進(jìn)行分析或者在分析過程中樣品會(huì)排隊(duì)進(jìn)樣，在這個(gè)過程中固體分散體的穩(wěn)定性可能會(huì)降低導(dǎo)致重結(jié)晶的發(fā)生，從而影響樣品分析的準(zhǔn)確性。因此本研究采用冷藏法與溶劑稀釋的方法來保存尚未分析的體外溶出的樣品并與未經(jīng)處理的樣品進(jìn)行對(duì)比，來考察兩種方法對(duì)泊沙康唑固體分散體體外溶出樣品穩(wěn)定性的影響。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀 器

BSA124S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-200KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)，盧湘儀；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；TA-Q2000差示掃描熱分析儀，美國TA公司；X-射線衍射儀，德國布魯克AXS有限公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；藥物溶出儀，天津天大天發(fā)科技有限公司；冰箱，青島海爾科技有限公司；雙螺桿熱熔擠出機(jī)，Thermo Fisher Scientific；高速多功能粉碎機(jī)，上海拜杰實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試 劑

泊沙康唑，浙江奧翔藥業(yè)股份有限公司；HPMC AS(MG)，日本Shin-Etsu 公司；甲醇、磷酸、鹽酸、磷酸三鈉、氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫80，南京威爾有限公司；乙腈，TEDIA公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 泊沙康唑固體分散體的制備

將泊沙康唑原料藥與高分子載體HPMC AS分別粉碎過80目篩網(wǎng)，按1:3(w/w)比例準(zhǔn)確稱取過篩后的泊沙康唑原料藥與HPMCAS，過60目篩網(wǎng)混合均勻、備用。將熱熔擠出機(jī)溫度設(shè)置為140 ℃，轉(zhuǎn)速為50 r/min，將預(yù)先混合的泊沙康唑與高分子載體混合物投入熱熔擠出機(jī)中，收集制備完成的擠出物，即得泊沙康唑固體分散體。將固體分散體粉碎過60目篩網(wǎng)并收集物料。

1.3.2 泊沙康唑固體分散體表征

(1)差示掃描量熱法(DSC)

分別取泊沙康唑原料藥、泊沙康唑固體分散體、泊沙康唑物理混合物(1:3)適量，置于鋁制樣品盤中，壓蓋備用。采用標(biāo)準(zhǔn)模式程序進(jìn)行測(cè)試，加熱速率10 ℃/min，升溫范圍為0～180 ℃。

(2)X-射線衍射(XRD)

本研究在X射線衍射儀中獲得粉末樣品的X射線衍射圖，將適量粉末樣品放置在樣品盤上，通過從5°～70°(2θ)掃描獲得衍射圖，圖譜將涵蓋樣品的所有衍射峰。分別取泊沙康唑原料藥(a)、泊沙康唑熱熔擠出物(b)、高分子載體HPMC AS(c)適量，通過連續(xù)掃描的方式，Cu靶Kα射線，電流30 mA。

1.3.3 體外分析方法的建立

(1)色譜條件

色譜柱：Zorbax SB 苯基柱(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相為：乙腈(HPLC級(jí)):水:磷酸=36:64:0.15(v/v/v)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃。

(2)專屬性

精密稱取泊沙康唑原料藥20 mg，固體分散體80 mg，高分子載體60 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇超聲溶解，用pH 6.8含0.37%吐溫80的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，得200 μg/mL的原料藥溶液，樣品溶液，空白輔料溶液，分別精密量取1 mL上述溶液，至25 mL容量瓶中，用pH 6.8含0.37%吐溫80的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，作為供試溶液a, b與c，取供試品溶液a，b，c與空白溶劑d，離心(12000 r/min，10 min)取上清液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。

(3)線性

取上述200 μg/mL的原料藥溶液，用pH 6.8含0.37%吐溫80的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為4，10，20，40，100，150 μg/mL的系列溶液，離心(12000 r/min，10 min)取上清液，進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算線性。

(4)精密度

分別取濃度為10 μg/mL的泊沙康唑?qū)φ掌啡芤哼m量，離心(12000 r/min，10 min)，取上清液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄對(duì)照品峰面積。

1.3.4 體外溶出方法

腸溶制劑的溶出度實(shí)驗(yàn)包括耐酸性考察和溶出度考察兩部分，本實(shí)驗(yàn)參照《中國藥典》2020版四部溶出度測(cè)定法及FDA的溶出數(shù)據(jù)庫的溶出方法：第一階段(耐酸性實(shí)驗(yàn))：槳法，轉(zhuǎn)速為75 r/min，溫度為(37±0.5) ℃，溶出介質(zhì)為 750 mL的0.1 mol/L的鹽酸溶液。取上述制備的泊沙康固體分散體(載藥量100 mg)，分別投入溶出杯中，測(cè)試2 h；第二階段(溶出度實(shí)驗(yàn))在第一階段的結(jié)束后，加入250 mL 含有1.46% 的吐溫80的0.2 mol/L磷酸鈉緩沖溶液，最終溶出介質(zhì)pH為6.8(必要時(shí)用2 mol/L鹽酸溶液或2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至6.8)，體積為1000 mL，在130、135、140、150、165、180、240 min取溶液10 mL，濾過，液相進(jìn)樣測(cè)定，同時(shí)補(bǔ)充10 mL 新鮮介質(zhì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性

專屬性色譜圖見圖1，空白輔料和空白溶劑在泊沙康唑相同保留時(shí)間處未見色譜峰，表明空白輔料對(duì)泊沙康唑的測(cè)定無干擾，專屬性良好。

圖1 專屬性色譜圖Fig.1 Specific chromatogram

2.2 線 性

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)擬合回歸直線，得到回歸線性方程y= 38.074x-4.7435，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，表明泊沙康唑在4～150 μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 精密度

結(jié)果見表1，峰面積 RSD =0.23%，小于2.0%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度考察Table 1 Precision survey

2.4 DSC表征

將樣品進(jìn)行熱分析，結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示泊沙康唑原料藥以及泊沙康唑物理混合物在168.44 ℃有明顯的吸收峰，此溫度為泊沙康唑的熔點(diǎn)，但經(jīng)擠出后吸收峰消失，表明藥物已成為無定形態(tài)。

圖2 DSC曲線圖Fig.2 DSC curve of sample

2.5 XRD表征

樣品的X射線衍射結(jié)果見圖3，泊沙康唑原料藥有明顯的衍射峰，藥物經(jīng)熱熔擠出后無衍射峰，表明泊沙康唑以無定型狀態(tài)分散在載體中。

圖3 X-射線衍射圖Fig.3 XRD pattern of sample

2.6 體外溶出度實(shí)驗(yàn)

分別取上述制備的泊沙康唑固體分散體6份(載藥量100 mg)置于上述溶出條件下進(jìn)行溶出度考察。在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取出溶液過濾3 mL后，取濾液適量置于安瓿瓶中。分別將樣品室溫下(25±2 ℃)放置，溶出介質(zhì)稀釋一倍置于室溫(25±2 ℃)，冷藏(2～4 ℃)放置，在24 h和48 h后取對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行離心(12000 r/min，10 min)，取上清液, 按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，按照外標(biāo)法計(jì)算樣品濃度，并繪制溶出曲線。并以0 d的溶出曲線作為對(duì)比，考察24 h，48 h后三種方法處理后樣品的穩(wěn)定性結(jié)果。

根據(jù)上述方法分別處理體外溶出的樣品，并對(duì)低溫冷藏處理與溶出介質(zhì)稀釋一倍處理及未經(jīng)處理室溫放置所得體外溶出樣品的溶出曲線進(jìn)行分析，溶出曲線見圖4。由圖可以發(fā)現(xiàn)未經(jīng)處理的體外溶出樣品在室溫放置的情況下其穩(wěn)定性較差，與0 d相對(duì)比室溫放置24 h與48 h后其溶出度明顯下降，固體分散體采用的是腸溶高分子載體，在pH為6.8的溶出介質(zhì)中藥物快速釋放達(dá)到過飽和狀態(tài)，而處于過飽和狀態(tài)的無定型藥物在放置過程中易發(fā)生重結(jié)晶致使藥物的濃度降低，24 h與48 h藥物的濃度大約分別降低了15%和35%。而經(jīng)溶出介質(zhì)稀釋一倍和冷藏處理后體外溶出的樣品穩(wěn)定性較好樣品的濃度與0 d相比十分接近，并且經(jīng)冷藏處理的樣品其穩(wěn)定性還略優(yōu)于經(jīng)溶出介質(zhì)稀釋處理的樣品。

圖4 不同條件處理溶出樣品的溶出曲線(n=6)Fig.4 Dissolution curves of dissolution samples treated under different conditions(n=6)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過熱熔擠出技術(shù)制備了泊沙康唑固體分散體，DSC與XRD表征表明，以晶態(tài)存在的泊沙康唑經(jīng)熱熔擠出后成為非晶態(tài)從而改善了其溶解度。當(dāng)無定型藥物與溶出介質(zhì)接觸時(shí)，快速溶解的藥物分子會(huì)產(chǎn)生過飽和溶液，這可能會(huì)導(dǎo)致無定型藥物從溶液中重結(jié)晶。當(dāng)采用溶出介質(zhì)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋一倍處理降低了藥物的過飽和濃度，延長(zhǎng)了亞穩(wěn)態(tài)區(qū)，延緩了成核的時(shí)間，提高了樣品的穩(wěn)定性。而當(dāng)?shù)蜏貎?chǔ)存體外溶出的樣品，降低了體系所處的溫度，從而降低了分子的遷移率，延緩藥物的聚集，從而抑制藥物的重結(jié)晶，提高了樣品的穩(wěn)定性，并且低溫放置的樣品穩(wěn)定性效果較溶劑稀釋法略優(yōu)。溶劑稀釋法雖然也可以提高固體分散體的溶出樣品的穩(wěn)定性，但是會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來在操作上失誤，從而導(dǎo)致樣品的分析結(jié)果存在誤差影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，相反低溫冷藏法操作簡(jiǎn)單便捷且避免了繁瑣的操作。