杠板歸多糖提取工藝優化及其體外抗氧化活性研究*

梁珊珊，魏 晴，薛 娟，熊 瑞，杜洪志，陳志琳，李 瑋

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

杠板歸為蓼科植物杠板歸PolygonumperfoliatumL. 的干燥地上部分[1]，又名蛇不過、蛇倒退、蛇牙草、河白草、老虎刺等[2-3]，資源分布廣泛，主要分布于貴州、四川、湖南、廣西等地。具有清熱解毒，利水消腫，止咳等作用。一般用于咽喉腫痛，肺熱咳嗽，小兒頓咳，水腫尿少，濕熱瀉痢，濕疹，癤腫，蛇蟲咬傷等[1]。在貴州，杠板歸屬于苗藥，在苗族用來治療咳嗽、發熱以及食物中毒等[4]。現代研究發現，杠板歸具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗流感病毒、抗癌、保護肝臟等作用[5-6]。臨床上用于治療咳嗽、細菌性痢疾、痔瘡、燒傷、帶狀皰疹、急性腎炎等[7]。其化學成分主要包括黃酮及其苷類、醌類、萜類、酚羧酸類化合物、苯丙素糖酯及其衍生物類、酰胺類以及糖類化合物[5]。

現代研究表明，多糖具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗氧化、抗菌抗病毒、保護肝臟等作用[8]，關于杠板歸多糖的提取方法有響應面法[9]、纖維素酶法[10]、丙酮沉淀法[11]，但利用超聲波法提取杠板歸多糖的工藝條件和體外抗氧化活性的研究尚未見報道。本研究采用超聲法提取杠板歸多糖，通過提取溫度、提取時間、超聲功率、料液比4個因素確定影響多糖含量的主要因素，應用L9(34)正交表進行試驗設計，確定最佳的提取工藝條件，并進行驗證性試驗，同時以抗壞血酸(VC)為陽性藥，對比杠板歸多糖的體外抗氧化活性，以期為杠板歸藥材的進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

杠板歸飲片(批號20160501)，貴州同濟堂有限公司；D-無水葡萄糖對照品(批號：110833-201707，純度>99.5%)，信陽市中檢計量生物科技有限公司；DPPH(批號：145356，純度>97.0%)，北京中科質檢生物技術有限公司；ABTS(批號：1436401)，純度>98%，北京中科質檢生物技術有限公司；維生素C(編號：91184，純度≥99%)，信陽市中檢計量生物科技有限公司；重蒸苯酚、濃硫酸、無水乙醇均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

UV2500紫外可見分光光度計，日本島津公司；AB265-S電子分析天平，梅特勒；101恒溫鼓風干燥烘箱，紹興市上虞區道墟恒幸儀器設備廠；SCQ-5201C超聲波清洗機，上海狄星有限公司。

2 實驗方法

2.1 標準曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法測葡萄糖標準曲線。精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品5.0 mg，用蒸餾水溶解并定容至50 mL的容量瓶中，得到0.1 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。精密量取0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0及1.2 mL分別置于10 mL具塞試管中，用蒸餾水補至2.0 mL，再分別加入1.0 mL 的6%苯酚搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL搖勻，放置5 min后，置沸水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫。另以蒸餾水2.0 mL，同上操作為空白對照，于490 nm波長處測定吸光度值。同一濃度的標準溶液分別重復測定3次。以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為y=0.0142x+0.0069，R2=0.9957。

2.2 杠板歸多糖的制備

取杠板歸干燥粉末過20目篩，稱取2 g粉末置于50 mL平底燒瓶中，加入20 mL的蒸餾水，超聲輔助提取30 min，取濾液即得杠板歸多糖。

2.3 杠板歸多糖的含量測定

精密量取杠板歸多糖提取液0.1 mL至10 mL具塞試管中，加蒸餾水補至2 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，搖勻，再加5 mL濃硫酸，于沸水浴鍋中顯色15 min后，取出冷卻至室溫。同時制備空白對照組樣品，于490 nm處測定吸光度。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

精確量取1.0 mL濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，按2.3實驗方法測定吸光度，平行測定6次，記錄吸光度值并計算RSD值。計算得到RSD為0.70%，表明該儀器的精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗

精確量取1.0 mL濃度為0.1 mg/mL的杠板歸多糖溶液，按2.3實驗方法測定溶液中的多糖含量，分別于0、2、4、6、8、12、24 h測定吸光度，并計算RSD值。計算得到RSD為1.20%，表明杠板歸多糖在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗

精確配制6份0.1 mg/mL的杠板歸多糖溶液，按2.3實驗方法測定溶液中的多糖含量，記錄吸光度值，并計算RSD值。計算得到RSD為1.67%，表明該方法的重復性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗

精密稱取2.5 mg已知多糖含量的杠板歸粉末6份，置于25 mL容量瓶中，再分別加入20 mL 0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液，按照2.3實驗方法測定吸光度值，計算得到平均回收率為99.0%，RSD為1.24%，表明該方法的回收率良好。

2.5 單因素考察

在超聲功率為50 W，時間為30 min，料液比為1:15 g/mL時，考察提取溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)；在超聲功率為50 W，溫度為100 ℃，料液比為15 g/mL時，考察提取時間(20、30、40、50、60、70 min)；在提取時間為30 min，溫度為100 ℃，料液比為1:15 g/mL時，考察超聲功率(40、50、60、70、80、90 W)；在超聲功率為50 W，提取溫度為100 ℃，提取時間為30 min，考察料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL)等4個因素對多糖含量的影響。

2.6 正交試驗設計

精確稱取杠板歸粉末9份，每份約2.0 g，選取提取溫度A(℃)、提取時間B(min)、超聲功率C(W)、料液比D(g/mL)各3個水平進行正交試驗L9(34)，以多糖含量(mg/g)為評價指標，考察杠板歸多糖的最佳提取工藝條件，正交因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test factor level

2.7 體外抗氧化實驗

2.7.1 杠板歸多糖對DPPH·的清除作用

按照文獻[12-13]的方法，量取2 mL 0.5 mmol/L DPPH乙醇溶液、2 mL待測樣品溶液于10 mL的具塞試管中，充分搖勻，在室溫下靜置30 min，并注意避光。此外空白對照組選用無水乙醇進行操作，在517 nm處測定相應的吸光度值為A1，平行測量3次。取4 mL DPPH乙醇溶液于10 mL的具塞試管中，在室溫下避光靜置30 min，在517 nm處測定其吸光度值A0，平行測量3次。量取2 mL的無水乙醇，再加入2 mL待測樣品，搖勻，室溫下避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度值A2，平行測量3次。以VC作為陽性對照組。按下列公式計算DPPH·清除率，并計算待測樣品的IC50值。

DPPH·清除率%=[1-(A1- A2)/ A0]×100%

式中：A0為DPPH乙醇溶液的吸光度；A1為DPPH乙醇溶液中加入樣品溶液得到的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度。

2.7.2 杠板歸多糖對ABTS+·的清除作用

按照文獻[14-15]的方法，制備ABTS+·儲備液：取20 mL 7.5 mmol/L K2S2O4溶液和40 mL 7.5 mmol/L ABTS 溶液均勻混合，室溫下避光靜置15 h。制備ABTS+·工作液：量取20 mL 儲備液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm 波長下吸光度值達0.70±0.01。取4 mL工作液和1 mL待測液混勻，避光靜置15 min后，在734 nm下測定吸光度值A1。取4 mL工作液，在734 nm下測定吸光度值A0。取4 mL蒸餾水和1 mL待測液混勻，在734 nm下測定吸光度值A2。平行測定3次。以Vc為陽性對照，以VC作為陽性對照組。按下列公式計算ABTS+·清除率，并計算待測樣品的IC50值。

ABTS+·清除率%=[1-(A1- A2)/ A0]×100%

式中：A0為工作液的吸光度，A1為工作液中加入樣品溶液得到的吸光度，A2為樣品溶液的吸光度。

3 結果與討論

3.1 杠板歸多糖單因素考察結果

3.1.1 提取溫度對杠板歸多糖含量的影響

不同的提取溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)得到的杠板歸多糖含量分別為22.92，27.62，30.14，31.52，32.15，34.05 mg/g，由圖1可知，杠板歸多糖含量隨著提取溫度的升高而增高，由于高溫有利于多糖的溶出，因此杠板歸多糖的最佳提取溫度為100 ℃，而正交試驗提取溫度的3個水平選取為80 ℃、90 ℃、100 ℃。

圖1 提取溫度對杠板歸多糖含量的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on the yield of polysaccharide

3.1.2 提取時間對杠板歸多糖含量的影響

不同的提取時間(20、30、40、50、60、70 min)得到的杠板歸多糖含量分別為30.11，34.05，36.71，38.96，38.21，38.12 mg/g，由圖2可知，當提取時間在20～50 min范圍內，杠板歸多糖的含量隨著提取溫度的升高而增高。當提取時間繼續延長時，多糖含量下降并呈穩定趨勢。因此杠板歸多糖的最佳提取時間為50 min，而正交試驗提取時間的3個水平選取為40、50、60 min。

圖2 提取時間對杠板歸多糖含量的影響Fig.2 Effects of extraction time on the yield of polysaccharide

3.1.3 超聲功率對杠板歸多糖含量的影響

圖3 超聲功率對杠板歸多糖含量的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the yield of polysaccharide

不同的超聲功率(40、50、60、70、80、90 W)得到的杠板歸多糖含量分別為33.12，34.05，42.24，48.12，46.71，46.21 mg/g，由圖3可知，杠板歸多糖的含量隨著超聲功率的增大而增高。當提取時間繼續延長時，當功率達到70 W時，多糖含量達到最大值。因此杠板歸多糖的最佳提取功率為70 W，而正交試驗提取功率的3個水平選取為60、70、80 W。

3.1.4 料液比對杠板歸多糖含量的影響

不同料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL)得到的杠板歸多糖含量分別為29.76，34.05，32.28，29.52，27.12，18.12 mg/g，由圖4可知，當料液比為1:15 g/mL，杠板歸多糖含量達到最大值，并隨著料液比的增大而降低。因此杠板歸多糖的最佳料液比為1:15 g/mL，而正交試驗料液比的3個水平選取為1:10、1:15、1:20 g/mL。

圖4 料液比對杠板歸多糖含量的影響Fig.4 Effects of ratio of liquid to solid on the yield of polysaccharide

3.2 杠板歸多糖提取正交試驗結果

由表2可知，影響杠板歸多糖含量的提取因素大小順序為A>C>D>B，即提取溫度>超聲功率>料液比>提取時間。由K值可知，杠板歸多糖最佳提取工藝為：A3B2C2D2，即提取溫度為100 ℃，提取時間為50 min，超聲功率為70 W，料液比為15 g/mL。在此條件下的多糖含量為39.84 mg/g，結果表明所選工藝條件合理、可行，可作為杠板歸多糖的提取工藝。

表2 正交試驗結果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results

3.3 最佳工藝的驗證性試驗

為了確定所得的工藝條件科學合理，按照最佳工藝進行了3次平行重復性試驗，杠板歸多糖含量3次實驗平均結果為39.84 mg/g，RSD為0.93%，表明該工藝穩定，重復性良好。

3.4 杠板歸多糖抗氧化活性結果

3.4.1 杠板歸多糖對DPPH自由基的清除作用

由圖5可知，杠板歸多糖和VC對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加而增大，當杠板歸多糖和VC濃度達到120 μg/mL時，DPPH自由基的清除率達到最高，分別為88.11%和93.15%。杠板歸多糖和VC對DPPH自由基清除率達到50%時的濃度分別為46.39 μg/mL和44.23 μg/mL。當濃度在20～80 μg/mL范圍內，杠板歸多糖和VC清除DPPH能力相當，表明杠板歸多糖具有良好的清除DPPH自由基的能力。

圖5 杠板歸多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of polysaccharides on DPPH

3.4.2 杠板歸多糖對ABTS+自由基的清除作用

由圖6可知，杠板歸多糖和VC對ABTS+自由基的清除能力隨著濃度的增加而增大，當杠板歸多糖和VC濃度達到120 μg/mL時，ABTS+自由基的清除率達到最高，分別為88.11%和93.15%。杠板歸多糖和VC對ABTS+自由基清除率達到50%時的濃度分別為61.12 μg/mL和47.10 μg/mL，從IC50值可知，杠板歸多糖清除ABTS+自由基的能力弱于VC。

圖6 杠板歸多糖對TBST+自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharides on TBST+

4 結 論

本研究采用超聲法提取杠板歸多糖，利用苯酚-硫酸法在490 nm處測定多糖含量。通過對提取溫度、提取時間、超聲功率、料液比4個因素進行分析，建立L9(34) 正交試驗。經過數據分析得到影響多糖含量因素的主次順序為：提取溫度A>超聲功率C>料液比D>提取時間B，其中提取溫度影響顯著。而得到超聲法提取杠板歸多糖的最佳工藝條件為：提取溫度為100 ℃，提取時間為50 min，超聲功率為70 W，料液比為1:15 g/mL。在此條件下的多糖含量為39.84 mg/g。此外，體外抗氧化活性結果顯示，杠板歸多糖具有較好的清除DPPH和ABTS+自由基的能力，其IC50值分別為46.39 μg/mL和61.12 μg/mL，其中多糖對DPPH自由基的清除能力較強，表明杠板歸多糖具有良好的體外抗氧化活性。

另外，本研究采用超聲法提取杠板歸多糖，超聲提取法可以通過破壞植物細胞增加多糖的溶出率[12]。同時，超聲法具有簡單、方便、高效等特點。本研究對杠板歸多糖的提取、分離、結構解析、藥效研究等奠定了理論基礎。