大孔樹脂富集純化黃酮類化合物的研究進(jìn)展*

陳三達(dá)，喬娟娟，陸耕宇，謝國勇，秦民堅(jiān)

(中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

黃酮類化合物是一類廣泛分布于植物界且具有廣譜生物活性的多酚類植物次生代謝產(chǎn)物，其在高等植物如菊科、豆科、唇形科、玄參科、蕓香科、薔薇科等較為常見。植物中的黃酮類化合物可以保護(hù)植物免受紫外線輻射，以及寄生蟲和病毒等外來物的侵害[1-2]。就藥理作用而言，黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)腸道免疫功能等作用[3-5]。

目前黃酮類化合物的純化方法包括大孔樹脂法、重結(jié)晶法、萃取法、膜分離技術(shù)、金屬絡(luò)合法、活性炭吸附法、制備型液相色譜法等多種技術(shù)，其中大孔樹脂因其純化工藝具有操作簡單、無污染、能耗小且分離效果好等特點(diǎn)，在黃酮類化合物的純化研究中得到廣泛使用。本文通過查閱大量文獻(xiàn)，從樹脂結(jié)構(gòu)、分離成分類型、上樣條件、洗脫條件、樹脂重復(fù)利用次數(shù)五個方面，探討影響大孔樹脂純化效果的因素，并分析了目前大孔樹脂的應(yīng)用缺陷和存在的問題，以期為利用大孔樹脂富集純化黃酮類化合物的研究提供借鑒。

1 樹脂類型及結(jié)構(gòu)

表1 常見純化黃酮類化合物的大孔樹脂物理參數(shù)Table 1 Basic physical parameters of common macroporous resins in the purification of flavonoids

續(xù)表1

樹脂篩選是純化工藝的首要環(huán)節(jié)，也是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。篩選樹脂時，應(yīng)根據(jù)化學(xué)成分的極性判斷所需的樹脂類型。對于極性較小的化合物而言，使用非極性樹脂和弱極性樹脂純化效果較好，而極性較大的化合物則適用于中極性樹脂[6]。同時樹脂的吸附性能也受其他其物理參數(shù)如比表面積、孔徑等因素的影響。目前常用于富集純化黃酮類化合物的大孔樹脂基本物理性質(zhì)如表1所示。

2 分離成分類型

表2 不同黃酮類化合物選用的大孔樹脂類型Table 2 The type of macroporous resin in separating different flavonoids

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，因此在篩選樹脂時，需要充分考慮被分離黃酮成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。大多黃酮類化合物呈弱極性，故弱極性和非極性的樹脂對黃酮類化合物的純化效果較好。表2總結(jié)了近年來富集純化不同黃酮類化合物所使用的樹脂類型。從表2中可看出目前純化黃酮類化合物以AB-8、D101、HP-20、以及HPD系列的樹脂應(yīng)用較多。

3 上樣條件

3.1 上樣液質(zhì)量濃度

上樣液質(zhì)量濃度的大小會影響樹脂的吸附性能，一定范圍內(nèi)，樹脂吸附量隨著濃度的增加而增加，但當(dāng)上樣液濃度過大時，吸附量便會降低。石子林等[52]考察了樣品質(zhì)量濃度對密花香薷總黃酮吸附效果的影響，當(dāng)上樣液濃度逐漸升高時，吸附率也隨之升高；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度>3.51 μg/L后，吸附率反而下降。

上樣液濃度過低時，導(dǎo)致樹脂吸附量少，造成樹脂浪費(fèi)且純化效率低；濃度過高，樣品泄露會提前，甚至出現(xiàn)樹脂堵塞的現(xiàn)象。因此，上樣前需先對樣品溶液進(jìn)行一定的處理，避免上樣后造成樣品和樹脂的損耗。

3.2 上樣液pH值

上樣液pH值作為影響樹脂吸附量的一個關(guān)鍵因素，它通過影響溶液中分子的穩(wěn)定性和溶解性，從而影響樹脂的吸附量[53]。大多數(shù)黃酮類化合物屬于弱酸性羥基酚類，當(dāng)pH值小于7時，它們以分子形式存在，并以氫鍵力被樹脂吸附[54]；當(dāng)pH值大于7時，黃酮類化合物與樹脂形成氫鍵的能力被破壞，導(dǎo)致樹脂吸附能力下降。因此，在設(shè)計(jì)上樣液的pH值時，應(yīng)重點(diǎn)考慮pH值偏酸性的梯度設(shè)置，但pH值也不宜過低，過低容易使黃酮產(chǎn)生鹽，導(dǎo)致樹脂吸附量減少[55]。如表3所示，富集純化總黃酮時，一般篩選出的最佳上樣液pH值多在3-7的范圍內(nèi)。

表3 上樣液的最佳PH值及流速實(shí)例Table 3 Example of optimum pH and flow rate of loading solution

3.3 上樣流速

上樣流速影響大孔樹脂吸附率及吸附量，若流速過慢，孔內(nèi)液體流動變緩，使接觸面減小，吸附率降低[55]；流速過快，黃酮類化合物與樹脂相互作用時間短，導(dǎo)致吸附不完全，吸附量減少。如表3所示，純化工藝研究中流速多以1～4 BV/h或1～3 mL/min為宜。

3.4 上樣體積

上樣體積受到上樣濃度、上樣流速等因素的影響，一般作為上樣條件考察的末端環(huán)節(jié)。彭偉文等[68]研究中上樣液體積為2.99 BV時，總黃酮濃度為0.139 mg/mL，此時未出現(xiàn)泄露；但當(dāng)上樣體積為3.29 BV時，出現(xiàn)明顯泄露現(xiàn)象。故確定最大上樣體積不宜超過3 BV。上樣體積與上樣液泄露點(diǎn)的出現(xiàn)有關(guān)，通常將流出液中目標(biāo)化合物的濃度達(dá)到上樣液質(zhì)量濃度的10%，認(rèn)定為樹脂吸附泄漏點(diǎn)[69]。

4 洗脫條件

4.1 除雜劑

上樣完成后，樹脂吸附黃酮成分時，不可避免的截留了部分鹽類、糖類等雜質(zhì)。因此需要通過洗滌除掉部分雜質(zhì)，從而提高產(chǎn)物純度。影響除雜效果的主要因素包括除雜劑種類、組成和用量。表4中，歸納了幾種常見的除雜方式。

表4 幾種常見除雜方式Table 4 Several common methods to remove the impurity

4.2 洗脫劑濃度

富集黃酮類化合物時，通常采用一定濃度的乙醇可達(dá)到洗脫效果。低濃度洗脫劑雖可提高洗脫效率，但耗時較長；而高濃度洗脫劑則可能將部分弱極性或非極性的雜質(zhì)也一并洗脫下來，導(dǎo)致產(chǎn)物純度降低。Hou等[69]研究發(fā)現(xiàn)乙醇濃度在20%～50%范圍內(nèi)，解吸率逐漸增加，但當(dāng)乙醇濃度從50%增加到100%時，解吸率呈現(xiàn)下降趨勢。

4.3 洗脫流速

洗脫劑的洗脫流速大小，也是影響大孔樹脂解吸能力的因素之一。洗脫流速過快，黃酮類化合物與樹脂未充分接觸，導(dǎo)致解吸量下降；流速過低，解吸充分，但會影響生產(chǎn)效率。Wu等[41]研究中發(fā)現(xiàn)隨著流速從1 mL/min增加到3 mL/min，對鳶尾異黃酮的洗脫效果更好，峰型更窄，峰值更高。由于考慮到流速過快會導(dǎo)致洗脫劑與樹脂的接觸不足，最終確定2 mL/min為最佳洗脫流速。

4.4 洗脫劑體積

洗脫劑體積受到洗脫流速的影響，流速越大，洗脫體積就越大，對溶劑的消耗也就越多。總黃酮洗脫時可采用繪制洗脫曲線的方式確定最佳洗脫劑體積，當(dāng)洗脫下來的總黃酮回收率較大且加入洗脫劑也變化不大時，可認(rèn)為該體積為適宜洗脫劑用量。Zhang等[77]用75%乙醇對吸附的落新婦苷進(jìn)行解吸，在洗脫劑體積為2 BV時出現(xiàn)了富集峰，隨后急劇下降。在7 BV附近，落新婦苷的濃度低于2 mg/mL。積分結(jié)果表明，洗脫劑用量為4 BV時，落新婦苷的回收率可達(dá)95%以上，最終確定洗脫體積為4 BV。

5 樹脂重復(fù)利用次數(shù)

大孔樹脂在純化黃酮類化合物時可被重復(fù)利用，但當(dāng)樹脂利用到一定程度后，樹脂上的雜質(zhì)由于累積過多，導(dǎo)致樹脂被污染，吸附性能大大下降。鄒鴻飛等[78]考察D101樹脂的利用次數(shù)對香椿葉黃酮純化效果的影響，發(fā)現(xiàn)樹脂使用1次時，黃酮純度由6.0%提高至45.14%，當(dāng)使用6次后，黃酮純度降至34.43%。因此樹脂使用到一定次數(shù)后需要對其進(jìn)行再生處理，再生方法一般用95%的乙醇反復(fù)淋洗，必要時也可加入酸堿進(jìn)行處理[79]。

以上綜述的幾點(diǎn)是在總黃酮純化工藝研究中，一般需要考慮的因素。除此之外，在工藝優(yōu)化中還需要注意到徑高比、吸附溫度、吸附時間、洗脫劑pH值等都會影響成分的純化效果。在優(yōu)化工藝條件設(shè)計(jì)時，可選擇單因素考察、正交設(shè)計(jì)、曲面優(yōu)化等。同時篩選合理的工藝參數(shù)既要考慮到產(chǎn)物的收率與純度，又要結(jié)合生產(chǎn)效率與成本問題。

6 存在問題

大孔樹脂雖目前在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，具有良好的發(fā)展前景，但在運(yùn)用大孔樹脂時凸顯出的一些問題，仍然有待解決:(1)樹脂剛性不強(qiáng)，若流速過大會引起樹脂間擠壓過緊導(dǎo)致部分樹脂顆粒破碎，有效成分來不及被樹脂吸附就流出[80]；(2)不同廠家提供的大孔樹脂使用說明中的預(yù)處理和再生方法也不一致，沒有一定的行業(yè)準(zhǔn)則；(3)樹脂的預(yù)處理仍是多采用酸堿洗滌后，再用水洗。使用該預(yù)處理方式是否能徹底清除大孔樹脂中的有害殘留物質(zhì)，到目前仍沒有統(tǒng)一的答案和標(biāo)準(zhǔn)；(4)在純化工藝研究中也沒有統(tǒng)一規(guī)范的指標(biāo)，研究者篩選最佳樹脂方法不一致，對于純化效果的評價也存在差異[81]。對于上述大孔樹脂目前存在的問題仍有待進(jìn)一步解決和完善。

7 結(jié) 語

大孔樹脂作為一種選擇吸附性與可再生性的分離材料，具有良好的純化效果，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于各類中藥及制劑活性成分的富集純化。目前大孔樹脂在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸深入，預(yù)示在未來的工業(yè)大生產(chǎn)中大孔樹脂仍具有極大的發(fā)展空間和應(yīng)用價值。隨著化工技術(shù)的發(fā)展，大孔樹脂的質(zhì)量和效果有望得到進(jìn)一步的改善和提升，同時將大孔樹脂與其他純化手段相結(jié)合，可使得中藥中某些結(jié)構(gòu)復(fù)雜且難以分離的成分實(shí)現(xiàn)分離，從而推動中藥的深入研究和開發(fā)利用。